核染色 + 免疫荧光图像

为什么要做核染色+免疫荧光图像?

免疫荧光（immunofluorescence, IF）是一种广泛使用的基于图像的技术，用于可视化展示细胞中蛋白质的亚细胞分布，例如，细胞核可以用 DAPI 染色，而 T 细胞可以通过 CD3 识别。多重免疫荧光（multiplexIF, mIF）可以标记在组织切片上通过荧光显微镜同时扫描，Stereo-seq 生化流程和生信分析工具兼容 DAPI 和最多 6 个用户定义的 IF，从而实现对组织样本更多的空间研究。

核染色+免疫荧光图像的注意事项

由于每个免疫荧光（IF）都具有特定的荧光光谱，并且它们都同时应用于同一组织切片上，对于 IF 的选择和显微镜成像系统两个方面都具有较大的挑战。因此管理您选择的 IF 之间的光谱重叠程度至关重要，另外成像系统可用的激发波长和发射波长也要考虑。

荧光显微镜通过两种方法扫描带有 IF 标记的组织区域：在相同扫描区域切换滤光片，直到扫描完整个组织区域，或者在扫描整个组织区域后切换滤光片。这两种方法都需要在每次扫描之间保持芯片不动，以确保IF图像中的组织位置在角度和尺度方向上保持一致。

StereoMap 和 SAW 中处理的 DAPI + mIF 图像为 8 位/16 位深的灰度图像。（有关更多信息，请参见图像类型和格式）

荧光图像	数据类型和格式
灰度图像	8/16位的单通道图像

第一步：上传图像

点击选择框中的 Choose file，选择一个兼容的图像文件或者也可以将所选文件直接拖入到选择框中。如果您输入的文件是.tar.gz或.stereo，请将其拖入左侧选择框中。如果您输入的文件格式是.tif或.tiff文件，则需要将核染色 DAPI 图像拖放到左侧框中，并将所有IF图像一起选择并拖到右侧框中。

请参考图像处理输入文件以获取更详细的图像文件信息。

选择文件后会触发一个文件解析的过程，该过程不仅会读取图像，还会从输入中获取必要的信息，解析的时间会因文件类型和图像大小有所差异。在图像处理步骤，Stereo-seq 芯片序列号（SN）和显微镜配置会提供重要的参考信息，如果输入的文件是.tar.gz 或者 .stereo，则信息已写入到输入文件中；如果输入的文件格式为.tif 或者.tiff，则需要在此步骤中输入指定的必要信息，以开始做图像的解析和质控。一般情况下，您可以选择显微镜配置来输入有关显微镜的信息。请参阅显微镜信息配置获取更多信息。

如果图像质控完成，您可以查看每个 QC 指标前指示器的状态。这些指示器与图像处理结果相关，您可能会在步骤标签上看到一些提示图标，指示某个步骤的潜在风险。

图标	说明
	完成。您已经完成了此步骤。
	警告。您可能需要特别注意这一步骤。图像质量对于自动操作来说并不理想。例如，如果您在第 2 步图像配准时看到此警告，这可能表明 SAW 中的自动配准可能出现了错误。您需要检查结果并手动进行调整。
	错误。您的图像有问题，无法在此步骤中处理。

第二步：图像配准

在该步骤中，您需要调整图像的方向、角度和尺度，以使其与空间特征表达矩阵对齐。

如果您在第一步中：上传了 .stereo文件，进入第二步时，您就可以同时看到图像和空间特征表达矩阵；上传了 .tar.gz 或 .tif/.tiff 图像文件，在第二步您需要选择一个.stereo 文件来指定空间特征表达矩阵，可以点击选择 .stereo 文件。此外，如果您在第一步上传了.stereo 文件（包含图像文件），想更改第二步展示的空间特征表达矩阵文件，您也可以点击重新加载一个新的矩阵文件，但还是使用第 1 步上传的.stereo的图像。

手动配准过程包括两个阶段：根据组织形态粗略的匹配图像的方向，然后精细调整图像的位置和尺度，确保与空间特征表达矩阵完全重叠。您还可以通过 Chip trackline ，辅助进行精细对齐。

为了粗略对齐图像，您需要将显微镜图像与特征矩阵方向变换为一致。

使用翻转工具可以将图像绕Y轴镜像翻转。
点击旋转按钮使用可以将图像以相同的方向旋转。

当图像方向跟表达矩阵方向一致时，您就可以继续进行精细对齐了。

做精细配准时，您需要将图像移动到有组织覆盖的区域。

通过平移面板 设置移动的步长和移动的四个方向（上、下、左、右）。
因显微镜拍摄的图像数据的尺寸跟特征矩阵不同，您可以使用缩放工具来调整缩放的比例。

您可以勾选 Chip trackline 显示参考轨迹线模板，辅助对齐图像。此时，参考轨迹线模板可以作为矩阵的一种表示形式，如果轨迹线较暗，可以手动调整图像的归一化、对比度、亮度和不透明度等工具按钮。

调整图像以便可以清楚的展示轨迹线。

饱和度的调整对灰度图像不适用。

对于 IF 图像，无法看到轨迹线，您可以依据 DAPI 核染色图像的参数进行大致对齐，然后基于形态进一步调整。

完成配准的图像将标记为已完成，请确保下拉框中所有的图像都已经完成。

如果做了手动配准，步骤 3 和 4 是可以跳过，您可以导出手动后的tar.gz图像文件，输入到 SAW 运行自动的组织分割和细胞分割。

另外，我们会输出*regist.tif 图像文件，该文件是配准后的图像，其形状和方向跟基因表达矩阵相匹配，此图像可以作为组织分割或者细胞分割的起点。如果您考虑使用第三方分割工具，强烈建议使用此图像文件作为输入，避免图像与 Mask 之间存在位移、角度和尺度的偏差。

第三步：组织分割

组织分割是个可跳过的步骤。

该步骤中，您需要识别组织区域，准确的识别组织边界可以减少背景干扰对于聚类结果的影响。基于图像的组织分割结果将映射到空间特征表达矩阵上，生成组织区域的表达热图。对于免疫荧光 IF 图像，选择具有强免疫荧光强度的区域相比勾勒组织边界更为重要。

如果您在第一步中上传了.stereo文件，您可以在配准后的图像图层上看到一个半透明的组织掩膜。

如果是.tar.gz或.tif/.tiff图像文件，您需要使用手动工具来绘制组织区域。

核染色图像的分割

在该步骤中，您可以编辑之前记录的组织掩膜或创建一个新的掩膜。如果是.tar.gz或.stereo文件中记录的组织掩膜将会在 Segmentation mask 下拉菜单中标记为 RECORD ，而通过手动绘制或导入创建的掩膜将标记为 CUSTOM 。如需更在画布显示的掩膜图像，只需从 Segmentation mask 下拉菜单中进行选择切换即可。

如果需要编辑组织区域的掩膜图像，可以使用套索、画笔和橡皮擦等工具的组合。套索一般用于选择或剔除大面积区域，而画笔和橡皮擦工具更适合于编辑组织周围或组织中的小孔等较小的区域。

您可以通过单击右侧面板上的 Segmentation mask 下拉菜单，单击来导入第三方分割工具创建的.tif格式的二进制掩膜文件，如果对于导入的结果不满意，您可以单击来替换新的掩膜文件。

免疫荧光图像的分割

Gray Scale 标签可以从免疫荧光图像中识别出蛋白活跃表达的区域。首先，从 Immunofluorescence image 选择调整的荧光图像。

其次，调整 Fluorescence intensity threshold 的滑块，则该所选阈值范围内的像素值将保留为免疫荧光的区域。

第四步：细胞分割

细胞分割是个可跳过的步骤。

细胞分割是生成单细胞空间分辨率数据的核心步骤。

当前版本，只对核染色图像 DAPI 做了细胞分割。

如果您在第一步中上传了.stereo文件，您可以在配准后的图像图层上看到一个红色的细胞/细胞核掩膜。

对于.tar.gz或.tif/.tiff图像文件，您需要使用手动工具来绘制细胞。

因只在组织区域的范围内展示对应的细胞分割结果，组织外的区域将会展示为黑色的背景。

类似于组织分割，您可以选择编辑之前已经记录的掩膜（标记为 RECORD ）或创建一个新的掩膜（标记为 CUSTOM ）。通过从 Segmentation mask 下拉菜单中切换画布中展示的掩膜。

使用套索、画笔和橡皮擦工具来编辑细胞。套索最适合用于取消大面积的背景，而画笔和橡皮擦工具更适合于较小的区域，例如标记某个细胞。

建议您使用配准后的图像导入到第三方分割工具创建.tif格式的二进制细胞掩膜文件。您可以通过单击右侧面板上的 Segmentation mask 下拉菜单，单击来导入第三方分割工具创建的.tif格式的二进制掩膜文件，如果对于导入的结果不满意，您可以单击来替换新的掩膜文件。

第五步：导出

最后是导出图像配准、组织分割和细胞分割的结果。单击 Export image processing record 将生成一个.tar.gz文件。

手动后的文件可以在 StereoMapWorkspace -> Processing 路径下查看，该路径位于您指定的保存路径中，默认为电脑的 D 盘，您可以在启动页的设置中修改保存路径。如果在第二步做了手动配准，此文件夹下会输出配准后的图像 *regist.tif ，如果您未做手动配准，该 TIFF 文件可以在 SAW 的输出目录 /outs/文件夹中找到。

.tar.gz文件包含原始的图像数据和手动处理的记录。此文件用于在SAW将图像数据和测序数据一起分析。.tar.gz文件的内部结构是固定的，不建议对其结构或者文件做任何修改。

*regist.tif文件是经过裁剪和调整的配准后的图像，跟特征表达矩阵尺寸相同。它可以在任何第三方分割工具中使用，并且生成的数据可以重新导入到 StereoMap。

手动后的图像结果 TAR.GZ 接回 SAW

手动后的图像数据有两种选择可以接回 SAW 跑后续分析。

其中一种选择为：运行SAW count流程，将手动后的图像文件.tar.gz作为--image-tar参数的输入。SAW count流程将 Stereo-seq 测序的 FASTQ 文件与手动后的图像文件一起分析，并生成 HTML 报告。

cd /saw/runs

saw count \
    --id=<ID> \
    --sn=<SN> \
    --omics=<OMICS> \
    --kit-version=<TEXT> \
    --sequencing-type=<TEXT> \
    --chip-mask=/path/to/chip/mask \
    --organism=<organism> \
    --tissue=<tissue> \
    --fastqs=/path/to/fastq/folders \
    --reference=/path/to/reference/folder \
    --image-tar=/path/to/image/tar

另一种选择为：运行SAW realign流程，将手动后的图像文件.tar.gz作为--realigned-image-tar参数的输入。SAW realign流程跳过比对步骤，基于手动后的结果文件重新生成配准后的图像数据，输出对应的矩阵文件，并生成 HTML 报告。

cd /saw/runs

saw realign \
    --id=<ID> \
    --sn=<SN> \
    --count-data=/path/to/previous/SAW/count/task/folder/id \
    --realigned-image-tar=/path/to/realigned/image/tar

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