在大脑回路中，单个神经元可以向位于附近或远处的其他神经元传递信号。因此，在单细胞水平上了解轴突投射的空间组织对于阐明各种大脑功能的神经回路至关重要。海马区（hippocampus，HIP）是学习、记忆、认知、应激反应和情绪行为所必需的大脑结构，与大脑皮层、丘脑、丘脑下部、嗅区和杏仁核等多个脑区有着广泛的联系。然而，目前仍不清楚HIP的单个神经元如何投射到整个大脑的目标区域，及其如何进行空间联接。因此，研究HIP单个神经元的全脑投射模式具有重要的科学意义。

采用稀疏标记法结合全脑精细成像技术—荧光显微光学切片断层成像（fluorescence micro-optical sectioning tomography，fMOST），重建了雄性小鼠（C57BL/6J，8至10周龄）的HIP单神经元投射形态。

采用华大自主研发的时空组学技术Stereo-seq，分析了包含HIP在内的小鼠（C57BL/6J，11周龄）脑组织冷冻切片。

1. 小鼠海马区单神经元全脑投射的三维重构

为重构小鼠HIP的单神经元投影景观，研究人员将稀疏标记方法与fMOST相结合，绘制了10,100个HIP神经元在HIP内和HIP外区域的轴突投射模式图，这些神经元的胞体遍布整个HIP（图1）。通过HIP单细胞投射图谱的数据库构建与分析，研究人员更加有效快捷地分析了小鼠HIP神经元的341种主要投射模式的形态相似性，并归纳总结出了43种全脑投射细胞类型。利用这些数据，研究人员创建了一个开放式在线数据库（https://mouse.digital-brain.cn/hipp），以便对重构的全脑单细胞投影进行交互式查询、可视化和分析。

图1 HIP神经元的投射细胞亚型分布图

2. 投射细胞类型与空间转录组数据的联合分析

为了研究各种投射细胞亚型中单细胞靶向模式（single-cell target patterns）的胞体位置，研究人员分析了最常观察到的50个靶向模式，发现具有独特靶向模式的神经元大多表现出胞体位置局限在纵向亚域，以及独特的HIP结构（HIP formation，HPF）内的投射模式和强度（图2）。

为了进一步研究HIP中投射细胞亚型的胞体分布与基因表达域之间的潜在对应关系，研究人员绘制了采用Stereo-seq分析小鼠HIP连续切片的CA1区的空间基因表达模式图（图3，数据可视化见https://mouse. digital-brain.cn/hipp）。

研究人员共获得了23张切片中的17,767个基因和56,445个细胞的数据。通过无监督聚类分析，将这些细胞划分成8个集群，其中3个集群显示出沿前后轴的特定空间偏好（图4）；其中转录组最丰富的集群（Cluster 1）被进一步划分为14个具有不同基因表达模式的亚群（图5）。这些结果表明，投射细胞亚型的分布可能反映了基因表达沿纵轴的空间模式。

图5 C1中的14个亚群及其标记基因表达

3. 靶区轴突分布与沿横轴和纵轴的胞体位置相关性

接下来，研究人员系统地探讨了在CA区中，HIP神经元的轴突投射模式异质性，这些神经元的胞体位于沿锥体细胞层（横轴）的同一横向平面内。胞体位置与Schaffer侧轴突顶端之间在横向平面上具有位置相关性，这一结果支持了CA3与CA1神经元活动在空间信息中的功能映射。研究人员进一步探讨了靶区HIP CA1神经元的轴突分枝与其胞体沿近-远端轴（P-D轴）的位置关系，最终发现CA1神经元在许多靶区的轴突分布与其胞体在CA1内的P-D位置有关（图6）。总之，这些结果揭示了HIP内CA3和CA1神经元胞体的位置结构，以及它们在HPF内外区域的轴突分布。

研究人员进一步将胞体的纵向位置与轴突末稍在各靶区的分布进行相关性分析，发现内嗅皮层（entorhinal cortex，ENT）中的轴突末稍位置与其在背-腹轴（D-V轴）上的胞体位置之间有很强的相关性（图7）。总体而言，神经元胞体的纵向位置是决定HPF外轴突投射异质性的关键因素。

该研究构建了目前世界上最大的单神经元全脑投射图谱数据集，结合华大自主研发的时空组学技术Stereo-seq，将获得的投射细胞类型与空间转录组数据联合分析，鉴定了与不同投射细胞类型空间分布相关的基因，展示了胞体与轴突末梢的空间映射关系，发现了HIP单神经元的空间投射规律，为未来HIP的神经回路的功能分析提供了有价值的参考信息。