数据再分析
本教程将将展示如何运行辅助分析流程 SAW reanalyze，进行聚类分析、差异表达分析和 lasso 区域的表达矩阵提取。
聚类分析
在生信下游分析中，聚类是一种关键且基本的算法处理，可将具有相似特征的空间表达点归为同组，该过程有助于揭示表达数据中的底层结构和模式。
在进行分析前，需要根据数据的物种和组织类型来选择合适的 bin size 例如，哺乳动物细胞的直径约为 10 µm，DNB 的物理间距为 500 nm，因此 bin20 会是一个合适的选择。
调用 Leiden 算法 进行聚类时，--Leiden-resolution 参数的默认值为 1.0，它可以调控 Leiden 聚类时的分群颗粒度，值越大，分群簇越多。并且，可以开启 --marker 参数，基于 Leiden 算法的分群结果进行差异表达分析。
如果使用 bin GEF 进行聚类，运行命令如下：
saw reanalyze \
--gef=/path/to/input/GEF \
--bin-size=20 \
--Leiden-resolution=1.0 \
--marker \
--output=/path/to/output/clustering
基于 bin GEF 的聚类输出如下：
clustering
├── <SN>.bin20_1.0.h5ad ##<SN>.<bin_size>_<resolution>.h5ad, containing analysis results
├── find_marker_genes.csv ##original output CSV
└── bin20_marker_features.csv ##formatted CSV for visualization in StereoMap
在运行分析时开启 --marker ，将获得与差异表达分析相关的结果，即 find_marker_genes.csv 和 <bin_size>_marker_features.csv。
find_marker_genes.csv是原始差异分析结果文件。<bin_size>_marker_features.csv是一个经过格式调整CSV，记录了每个类群的平均 MID count、L2FC、校正后的 p-value 和基因在类群内的表达占比等。
如果使用 cellbin GEF 进行聚类，运行命令如下：
saw reanalyze \
--cellbin-gef=/path/to/input/cellbin/GEF \
--Leiden-resolution=1.0 \
--marker \
--output=/path/to/output/folder
基于 cellbin GEF 的聚类输出如下：
clustering_analysis
├── <SN>.cellbin.gef ##a copy of input cellbin GEF but with new clustering information
├── <SN>.cellbin_1.0.h5ad ##<SN>.cellbin_<resolution>.h5ad, containing analysis results
├── find_marker_genes.csv ##original output CSV
└── cellbin_marker_features.csv ##formatted CSV for visualization in StereoMap
矩阵套索
StereoMap 中的交互式工具可以 lasso （手动圈选）感兴趣区域，它需要 SAW reanalyze 分析流程来协助将 lasso GeoJSON 中区域信息转化为特征表达矩阵。
.png)
如果使用 bin GEF 进行 lasso，运行分析如下：
saw reanalyze \
--gef=/path/to/input/GEF \
--lasso-geojson=/path/to/lasso/GeoJSON \
--bin-size=1,20,50 \
--output=/path/to/output/folder
--bin-size 参数可以接收一个列表，以便一次生成多个 bin size 的表达矩阵文件。
基于 bin GEF 的 lasso 输出如下：
Lasso
├── <label1>
│ ├── SN.<label1>.label.gef ##lasso GEF of bin1
│ └── segmentation
│ ├── SN.lasso.<bin_size_list[0]>.<label1>.gem.gz ##GEM of lasso area of different bin sizes
│ ...
│ ├── SN.lasso.<bin_size_list[n]>.<label1>.gem.gz
│ └── SN.lasso.<label1>.mask.tif ##mask image of lasso area
└── <label2>
├── ...
└── ...
如果使用 cellbin GEF 进行 lasso，运行分析如下：
saw reanalyze \
--cellbin-gef=/path/to/input/cellbin/GEF \
--lasso-geojson=/path/to/lasso/GeoJSON \
--output=/path/to/output/folder
基于 cellbin GEF 的 lasso 输出如下：
lasso
├── <label1>
│ └── SN.<label1>.label.cellbin.gef ##cellbin GEF of lasso area
└── <label2>
└── ...
差异表达分析
SAW reanalyze 可以使用来自 StereoMap 的 diffexp GeoJSON 文件，基于聚类类群选择和套索区域进行差异表达分析。
选定的聚类类群和套索区域被记录在 diffexp GeoJSON 文件中。
运行分析如下：
saw reanalyze \
--count-data=/path/to/previous/SAW/count/result/folder/id \
--diffexp-geojson=/path/to/StereoMap/diffexp/GeoJSON \
--output=/path/to/output/folder
--count-data 是相关联的SAW count 分析任务的输出目录，SAW reanalyze 将自动搜索差异表达分析所需的数据文件。相关信息记录在 *.diffexp.geojson 中。
差异表达分析输出如下：
Differential_expression
├── <SN>.<bin_size>_1.0.h5ad ##H5ad containing analysis results
├── find_marker_genes.csv ##original output CSV
└── <bin_size>_marker_features.csv ##formatted CSV for visualization in StereoMap
或：
Differential_expression
├── <SN>.cellbin_1.0.h5ad ##H5ad for cellbin containing analysis results
├── find_marker_genes.csv ##original output CSV
└── cellbin_marker_features.csv ##formatted CSV for visualization in StereoMap