A:HTML报告中的饱和度分析可评价测序数据的整体质量,为提高计算效率,在bin200维度下从成功注释reads中进行小样本随机抽样,故同一数据多次运行的结果可能略有区别,拟合公式不完全相同,但曲线整体形态一致。
图1:对抽样样本中的Unique Reads(CID、geneName和MID都唯一的reads)进行统计,饱和度值=1-(Unique Reads)/(Total Annotated Reads),随着抽样量增加,拟合曲线近平缓代表数据趋于饱和,是否加测需根据项目整体设计和样品情况而定,例如珍贵样品建议可加测,报告中的阈值0.8只作为建议指导的提示。
图2:随机抽样数量增加,bin200维度下的基因中位数逐渐增加。
图3:根据随机抽样样本的Unique Reads数据拟合而出的曲线,拟合曲线R² >=0.9。
(注:三张图片的x轴相同,y轴分为饱和度值、基因中位数和Unique Reads数量)
可通过spatialCluster模块中的-s参数设置不同的binsize选择,但需注意SAW直接输出的聚类结果默认只支持Bin200的结果展示,仅作为一个大致的参考。如果要进行更精确的聚类,推荐您使用Stereopy进行下游分析,这部分分析是在SAW之外的。
主要是可视化的功能,此外,如果配准异常,手动配准功能也可以通过StereoMap来实现。
• Option1:使用C++编译的 geftools:
1. https://github.com/BGIResearch/geftools
• Option2:使用python包 gefpy:
1. https://pypi.org/project/gefpy/
2. https://gefpy.readthedocs.io/en/latest/index.html
3. pip install gefpy==0.6.1
• Option3:如已安装SAW sif(如v5.1.3):
1. https://hub.docker.com/repository/docker/stomics/saw
2. singularity exec SAW_v5.1.3.sif cellCut
3. 请使用singularity 3.8及以上版本
Bash |
MID(Molecular ID)即分子编码,实验过程中每个mRNA分子带有唯一的MID,用于区分来源于不同mRNA分子的PCR扩增子。MID(即UMI)代表每个基因在每个分析单元中检测到的转录本数目。
{SN}.gef代表整张芯片全部数据,{SN}.tissue.gef代表组织区域数据,{SN}.cellbin.gef代表细胞分割后的数据,这三个gef文件是主要输出数据,是下游分析会使用到的,其他gef后缀文件,可以参考说明手册(时空官网链接:https://www.stomics.tech/products/BioinfoTools/OfflineSoftware/SAWOperationManual)<附录和参考文献>模块中的附录B。
主要目的是去除杂质,因为试剂中含有杂质,所以要离心。按照试剂盒使用说明书操作即可。
FcR主要封闭非特异性抗原结合的位点,如果不封闭,会与目标抗原非特异性结合而影响目标位点的判断。请登录BioLegend 官网查询是否有针对猴的,或者咨询一下抗体公司。
主要目的有:(1)确保选择的抗体适配于时空组学的mIF实验,可表达出正确的pattern;(2)根据滴定实验可以判断最佳的抗体浓度。
经过测试一抗、二抗添加与否并不影响透化时间的判断,只需要模拟前面的试剂孵育流程即可。