2024年9月9日，浙江大学樊龙江教授课题组携手华大生命科学研究院、西南大学、华南农业大学等顶尖研究团队，在期刊Developmental Cell（IF : 10.7）上以封面文章的形式，发表了题为“Spatiotemporal transcriptomic landscape of rice embryonic cells during seed germination” 的突破性研究成果。该研究创新性地运用了单细胞转录组测序技术，以及华大自主研发的时空组学技术Stereo-seq，首次绘制出水稻种胚在种子萌发过程中的单细胞分辨率空间转录组图谱，为相关领域的研究开辟了新的视角。
该研究利用吸胀24小时的种子构建了至今为止细胞类型最为完整的水稻胚细胞时空图谱。基于构建的胚细胞时空图谱，同时开展了水稻种子萌发过程中不同细胞类型的基因表达以及营养代谢、植物激素传导相关的关键基因通路。该研究为水稻胚细胞类型鉴定提供了重要空间图谱参考信息，为萌发过程不同类型细胞功能的分子生物学研究奠定了基础。
水稻胚细胞在种子萌发过程中具有重要作用。种子萌发是建立新生命的第一步，涉及到许多复杂的生物学过程。水稻种子胚胎由胚乳、胚和种皮三个主要组成部分组成，每个部分在种子的存活能力中发挥着独特而又重要的作用。种子萌发起始于种子吸胀，结束于胚根。萌发过程在种子吸胀后变化最明显，可以分为三个阶段：0-24、24-48、48-72小时（HAI），其中转录变化最显著的发生在0-24和24-48 HAI。胚胎中每种细胞类型通过对环境刺激的响应在种子萌发中具有特殊的功能。然而，我们对不同类型的胚细胞在种子萌发过程中的功能调控以及它们之间如何相互作用以形成新生命的复杂结构的了解还很有限。
本研究利用时空组学技术Stereo-seq和单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，捕获了水稻胚芽细胞在种子萌发过程中的空间分辨单细胞转录组。通过深度学习开发了自动化细胞分割模型，以满足分析要求。通过浸泡后的6、24、36和48小时的空间转录组揭示了已知和未报道的胚胎细胞类型，包括两种未报道的胚乳细胞类型，并通过原位杂交和标记基因的功能探索进行了验证。时空转录组图谱描绘了种子萌发过程中不同胚胎细胞类型中基因表达的动态变化，突出显示了以细胞类型特异性方式重新编程的参与营养代谢、生物合成和植物激素信号传导的关键基因。本研究提供了水稻胚胎的详细时空转录组图谱，并提出了一种全新的探索不同胚胎细胞在种子萌发中作用的方法。
文章概括图
1. 高质量的水稻种胚Stereo-seq和scRNA-seq数据
本研究收集了来自不同萌发时间点（6、24、36和48小时浸种后）的水稻种胚样品，通过华大Stereo-seq平台进行了52个胚切片的空间转录组测序分析，结果表明芯片上每个Bin50包含大约1200 UMI，平均基因数是583个；并且选取其中具有代表性的14个胚切片进一步分析。另外，作者对这4个时间点的27070个胚细胞原生质体进行了scRNA-seq测序分析，发现随着时间增加，平均基因数从1940个（6 HAI）升高至3117个（48 HAI），表明胚基因表达和代谢活动逐渐增强。
水稻萌发种胚的Stereo-seq和scRNA-seq实验流程图
为有效获得捕获每个细胞的RNA，本研究建立了一个利用FB染色技术可视化样本中的细胞壁的自动分割水稻胚胎细胞的流程。为了评估细胞分割模型的准确性，创建了一个专有数据集并训练高效且精确的自动化细胞分割模型，再使用一组指标，包括DICE系数的召回曲线和细胞面积的预测与地面真相的参数，来评估细胞分割模型的有效性。其中CP_embryo模型在细胞面积分布方面与真实值的匹配度最高。当阈值设置为0.5时，准确预测了超过87%的细胞。同时，细胞分割方法可以更准确地评估水稻种子胚芽不同组织区域的细胞大小引起的变异。使用细胞自动分割法还可以识别组织内部空隙区域，其基因的表达模式与环境的更接近。
不同的细胞分割模型的性能和CP_embryo分割识别效果
基于组织学特征和空间信息，首先将水稻胚胎分为五个解剖结构区域（PL，RA，CO，SC和EP-CR）。基于Marker基因的表达使用Seurat对空间数据进行无监督聚类分析，24小时浸种后的胚胎切片采用Bin50的细胞聚类分析，识别出13个不同的细胞群，这13个细胞群很好地注释为五个解剖区域中不同的细胞类型。
对于相同的24小时浸种后样本的细胞分割数据同样进行注释，并将结果与Bin50方法得到的结果进行了比较。细胞分割方法获得的细胞数目（n=5693）比Bin50方法（n=2398）更多。每个细胞的平均检测到的基因数目在细胞分割方法（n=163）中明显低于Bin50方法（n=649）。细胞分割数据的聚类结果识别出了上述13个细胞类型中的9个。结果表明，基于空间转录组数据，两种方法都可以通常用于定义细胞类型。
相比之下，细胞分割方法能更均匀的统计不同细胞类型之间RNA数，细胞分割增强了不同大小细胞之间基因表达分析的可比性。13个细胞类型中每个主要细胞类型都表达了独特的一组标记基因。RNA ISH和荧光原位杂交（FISH）的结果也验证了Stereo-seq鉴定的标记基因的空间分布。同时还观察到植物脂质转移蛋白（LTP）编码基因显示出细胞类型特异的表达模式。不同的LTP编码基因通过调节相应细胞类型中的脂质代谢和转运，在发芽的水稻种子中发挥不同的作用。
水稻胚胎细胞类型和空间聚类的注释
针对营养物质运输的关键区域——盾片（SC），前部分的研究结果表明SC 区域的细胞被聚类为五组，可进一步标注为五种细胞类型（SCL1、SCL1-2、SCL2、BESCL1-2 和 SCL3）。利用已知的Marker基因鉴定出SCL1和SCL3两种细胞。
在SCL1中，编码半胱氨酸蛋白酶OsSAG12-1（Os01g0907600）和α-淀粉酶糖蛋白AMY1A（Os02g0765600）的基因被高度表达，这与胚乳中淀粉的分解以及营养物质从胚乳到胚胎的运输是一致的。ISH 实验证实了OsSAG12-1在SCL1中的表达分布。
SCL3代表SC内的植物血管组织，但由于采集角度的限制，很难对这种细胞类型进行鉴定。在SCL3中发现了几种标记基因，如编码锌酵母蛋白的 SRZ1（Os03g0836200）和编码S-腺苷蛋氨酸羧化酶的SAMDC1（Os09g0424300），这两个基因在胚胎的血管组织的不同部位中表达水平也很高。
另外3种细胞类型（SCL1-2、SCL2和BESCL2），SCL2细胞类型包括多层薄壁细胞，位于SC内靠近PL和RA的位置，表达与水稻胚萌发相关的关键基因，并通过ISH验证了这些细胞类型的Marker基因空间表达分布。
为了进一步探索本研究所鉴定的标记基因的特性，研究人员产生了相应的突变体。以SCL2细胞中鉴定到的标记基因OsMFT2为例，通过敲除OsMFT2基因，并进一步通过表型实验观察发现，突变体的萌发率显著高于野生型。
为了深入分析这3种细胞类型的功能，作者利用scRNA-seq数据构建了其发育轨迹，并且找到了发育轨迹的关键差异基因。结果表明，萌发早期的细胞类型主要是SCL1-2，集中在肽合成相关的基因；萌发晚期的细胞类型主要是BESCL2细胞，与环境相应相关的基因开始富集。
盾片（SC）区域（24HAI）的细胞类型及其轨迹推断
该研究利用空间数据从6、24、36和48小时后的14个胚胎切片来研究种子萌发过程中的细胞和分子动力学。无监督聚类分析发现在所有分析的切片中（除了6小时后的切片外），细胞组成相似。同一时间点的不同切片之间的细胞比例没有显著差异，证实了实验和测序技术的稳定性。研究发现不同萌发时间点之间的细胞比例存在显著变化。SCL2和LS细胞在6到48小时后的比例呈下降趋势，而RA细胞的比例从6到48小时后明显增加。于是进一步对已鉴定的标记基因在四个时间点的表达模式进行了综合评估。
该研究还系统分析了整个萌发过程中各个细胞类型间植物激素、转录因子（TF）以及重要生理代谢的变化。该研究还使用Mfuzz 对6到48小时内稻胚胎的分子动力学进行了评估，其中，与细胞壁组成、微管细胞骨架、气孔发育、芽形态发生和表皮形态发生的途径相关的基因在萌发过程中表达水平持续升高。相应温度和水分、阳离子结合和叶绿体膜等相关的基因从6到24HAI表达下降，随后保持不变。细胞周期、ATP酶活性、有丝分裂细胞周期和DNA修复相关的基因在6到36HAI保持不变，随后表达急剧升高。
水稻种子萌发过程中胚的时空转录组景观
该研究还系统分析了整个萌发过程中各个细胞类型间植物激素、转录因子（TF）以及重要生理代谢的变化。结合Stereo-seq和scRNA-seq数据，发现在胚乳与胚间营养物质转运中起关键作用的α-淀粉酶和半胱氨酸蛋白家族基因在盾片表皮（SCL1）和盾片表皮-薄壁细胞中间层（SCL1-2）中显示出特异性高表达，并且随着萌发进行表达量逐渐上升。在胚芽和胚根细胞中，几种转录因子（如NAC、LBD、HSF、GATA和C3H）表现出显著逐渐降低的趋势，而其他转录因子（如E2F/DP、CAMTA、ARF和AP2）在整个萌发过程中表现出相反的趋势。与植物激素GA信号传导相关的基因在侧鳞和外胚乳细胞的基因表达水平随着萌发增加而上调，而与ABA生物合成相关的基因在盾片薄壁细胞中显著表达，并且随着萌发进程逐渐下降。
细胞类型分辨率下营养素和植物激素相关基因的表达模式
该研究使用Stereo-seq和scRNA-seq数据生成了发芽期稻胚胎的时空转录图谱，深度学习开发的自动细胞分割算法以单细胞分辨率深入了解了稻胚胎在发芽过程中的亚细胞转录组，为植物的空间转录组分析提供了有价值的工具。单细胞时空转录组数据使得成功区分了稻胚胎的5个解剖区域（PL、RA、SC、CO和EP-CR）的14种细胞类型及每个细胞类型的转录组特征和空间位置的显著差异。
研究发现了种子发芽过程中复杂的细胞类型级别的转录动态，并确定了SC区域中的两种以前未报道的细胞类型及其标记基因。研究结果揭示了参与各种细胞和分子过程的单个细胞类型的基因表达模式，包括植物激素的合成和信号传导、淀粉水解以及不同组织之间的营养运输。发芽期稻胚胎的时空转录组图谱为进一步探索种子发芽中不同组织和细胞类型的功能奠定了基础。
浙江大学农业与生物技术学院博士生姚洁、研究员褚琴洁，华大生命科学研究院副研究员郭兴、邵雯雯为本文共同一作。浙江大学樊龙江教授、华大生命科学研究院刘欢研究员为本文共同通讯作者。徐讯、储成才、邓水光、徐凡及朱乾浩等多位国内外科学家亦对该研究提供指导与支持。该研究是“揭榜挂帅”重点项目，并在海南省种业实验室（原海南省崖州湾种子实验室）与三亚华大生命科学研究院的资助与支持下完成。
关于“揭榜挂帅”：2022年，为加强种子科技关键技术攻关，研究解决种子产业链“卡脖子”技术和企业依靠自身力量难以解决的关键核心技术，海南省种业实验室与三亚华大生命科学研究院进行合作，资助科研机构开展技术攻关。双方针对企业发展的关键核心技术开展调研，凝练形成了“揭榜挂帅”重大技术需求（难题）榜单。经申报、审查、专家评审、联合审议等环节，海南省种业实验室与三亚华大生命科学研究院2022年联合 “揭榜挂帅”项目立项结果于2022年底正式公告。
