线下分析工具 - 华大时空

分析工具	系统要求	主要功能
ImageStudio	64-bit Windows 10	图像质控、图像拼接、组织分割、细胞分割
SAW	64-bit CentOS/RedHat 7.8 or Ubuntu 20.04	数据过滤、图像配准、表达矩阵获取和下游分析等
StereoMap	64-bit Windows 10 & 11	显微镜图像质控检查、可视化展示和交互式手动处理等

Q 分析时如何选择合适的binsize? 展开收起

A

可以按照不同组织类型的细胞大小等，根据下游分析效果多次调试bin20，50，100，200数值。其中bin20一般是动物细胞大小，bin50和100是常用于分析的binsize大小，bin200一般用于快速可视化效果展示。

Q ImageQC/ImageStudio、SAW、StereoMap的版本匹配关系？展开收起

A

需要注意：一、新版本软件可兼容旧版本功能；二、三个软件必须配套使用，即软件的不同版本号之间需要配套。现有不同版本号间的配套规则如下：

imageQC	ImageQC描述	SAW	SAW描述
<= 1.0.8	文件格式：.json + .tar.gz 描述：ssDNA图像QC	<= 4.1.0	支持组织分割和ssDNA图像配准
>= 1.1.0	文件格式：.ipr + .tar.gz 描述：ssDNA图像QC	>= 5.1.3	支持ssDNA图像细胞分割；支持Q4 FASTQ数据分析
ImageStudio	ImageStudio描述	SAW	SAW描述	StereoMap	StereoMap描述
1.0	文件格式：.ipr + .tar.gz 描述：ssDNA图像QC及手动处理	>= 5.5	支持ssDNA图像细胞分割；支持Q4 FASTQ数据分析；	1.0	支持空间表达热图展示；基因分布megre展示；ssDNA图展示及手动配准；
2.0	文件格式：.ipr + .tar.gz 描述：ssDNA、DAPI、mIF图像QC及手动处理	>= 6.0	支持mIF配准；支持rRNA过滤	2.0	mIF图展示；mIF图merge展示；
2.1	文件格式：.ipr + .tar.gz 描述：ssDNA、DAPI、mIF图像QC及手动处理；及QC失败图像的全手动处理；	>= 6.1 < 7.0	支持ImageStudio全手动处理图像接入流程；	2.1 < 3.0	支持多GEF一次性读入，通过切换标签展示
2.2	文件格式：.ipr + .tar.gz 描述：ssDNA、DAPI、mIF图像QC及手动处理；及QC失败图像的全手动处理；	>= 6.1 < 7.0	支持ImageStudio全手动处理图像接入流程；	2.1 < 3.0	支持多GEF一次性读入，通过切换标签展示
3.0	文件格式：.ipr + .tar.gz 描述：ssDNA、DAPI、H&E、mIF图像QC及手动处理；及QC失败图像的全手动处理；	7.0	count重构上线 register重构，升级组织分割和细胞分割V03算法。支持H&E全流程处理支持基于细胞分割的mask图像结果，使用EDM算法进行细胞修正。	3.0	支持读入不同binsize/resolution的h5ad；CGEF文件跑过SAW cellChunk模块后写入/codedCellBlock信息，加载CGEF时支持渲染cellbin热图
4.0（与StereoMap合并）	文件格式：.tar.gz（包含.ipr）描述：ssDNA、DAPI、H&E、mIF图像QC及手动处理；及QC失败图像的全手动处理；	8.0	使用pipeline进行分析支持FFPE样本分析（包含微生物部分）输出报告压缩包文件输出可视化压缩包文件	4.0	图像可视化：支持使用.stereo统领文件读取；兼容旧版本数据读取手动处理：使用step by step方式处理图像数据

Q 细胞分割的效果会受到什么因素的影响比较大？如何获得最佳分割效果？展开收起

A

1. 细胞分割的效果受到显微镜拍照的情况和分割算法等多重因素的影响。拍照时如果存在组织过曝、模糊等因素，会影响算法识别细胞，导致无法分割。对于密集区域本身清晰度不够，并且可能存在细胞重叠的情况，那么也会导致算法难以识别。如果图像中组织不同区域局部亮度不均匀、或者存在实验导致的拖尾、背景存在杂质等情况，也会导致分割错误。（部分示例见下方）

2. 从算法本身来讲，因为分析流程的自动分割算法是基于人工标注的数据集，学习训练而来，所以一些非常少见的细胞形态未能涵盖进数据集中，也可能会导致算法无法准确识别出细胞。

3. 如果自动算法分割效果不佳，可以尝试使用ImageStudio桌面端图像处理软件进行手动调整，也可以尝试用使用Stereopy或其他算法重新分割。如果希望细胞分割出的细胞面积更大，可以尝试在分割之后使用Stereopy的细胞修正算法对细胞直径进行扩大，以覆盖更大的面积。

Q SAW中对测序数据做了哪些过滤？展开收起

A

• CID过滤：过滤CID无法比对上mask文件的reads；

• MID过滤：过滤MID序列中含有N碱基的reads，过滤MID为polyA的reads，过滤含有至少一个以上质量值低于10的碱基的reads；

• reads过滤：过滤含有接头和dnb序列的reads。

Q 基因表达可视化结果异常，没有组织轮廓怎么办？展开收起

A

• 第一步：检查HTML报告中Valid CID Reads的比例是否正常，不可低于10%，如低于10%请确认测序FASTQ文件和芯片SN对应；

• 第二步：如Valid CID Reads的比例较低，在10%～30%左右，可能存在两种可能性：

￮参考基因组格式异常：Multi-Mapped Reads比例高， Uniquely Mapped Reads比例很低且几乎全部注释失败，需要检查注释使用的GTF/GFF文件是否符合格式要求，是否可以通过检测程序；

￮存在混样的可能性：需要自行排查实验部分；