华大生命科学研究院方晓东研究团队、中山大学魏泓研究团队等合作利用无菌（germ-free，GF）小鼠和无特定病原体（specific pathogen-free，SPF）小鼠模型，结合华大自主研发的时空组学技术Stereo-seq和DNBelab C4平台，揭示了微生物群能塑造小鼠脾脏的解剖结构和免疫功能，缺乏微生物群会导致小鼠脾脏分层结构紊乱，这对于理解微生物群在调节脾脏免疫功能中的关键作用具有重要意义，并为免疫相关疾病的潜在新治疗策略提供了见解。
该文章在2023年5月6日发表于Journal of Genetics and Genomics，在此，我们邀请第一作者张银博士对文章进行详细解读。
文章题目：Microbiota-Mediated Shaping of Mouse Spleen Structure and Immune Function Characterized by scRNA-seq and Stereo-seq
发表时间：2023-05-06
发表期刊：Journal of Genetics and Genomics
主要研究团队：华大生命科学研究院、中山大学等
影响因子：5.723
DOI：10.1016/j.jgg.2023.04.012
研究背景
肠道微生物群在人体生长发育、免疫系统、代谢系统、抵抗病原菌，以及疾病的精准诊断和治疗（微生物组关联分析法）等方面都发挥着非常重要的作用。胚胎发育过程中，脾脏作为造血器官，而随着骨髓造血功能的建立，脾脏演变成体内最大的外周免疫器官，负责启动对血源性抗原的免疫反应，过滤异物，并从循环中清除老化或受损的红细胞。重要的是，脾脏是唯一整合先天性和适应性免疫反应的免疫器官。微生物群在调节脾脏发育、影响脾脏的结构和大小方面也起着至关重要的作用。然而，目前仍不清楚微生物如何与脾脏相互作用或构成脾脏转录程序基础的分子机制。
为了探索微生物群在调节和塑造脾脏中的作用，研究人员联合使用Stereo-seq和scRNA-seq，全面检测SPF和GF小鼠脾脏在形态、大小、结构、细胞类型、细胞空间分布、细胞功能、差异基因表达活性和细胞相互作用的分子机制方面的差异，阐明了微生物群如何塑造小鼠免疫器官的解剖结构和功能，这将有助于设计针对免疫相关疾病的创新疗法和干预措施。
研究样本
Stereo-seq和scRNA-seq：2只10周龄雄性无特定病原体（SPF）小鼠和2只10周龄雄性无菌（GF）小鼠的脾脏样本。
血生化和血常规检测：10只SPF鼠和11只GF鼠的眼眶血样本。
研究成果
1.GF和SPF小鼠脾脏的免疫景观
研究人员对2只GF小鼠和2只SPF小鼠脾脏进行单细胞和空间转录组测序（图1），经过严格的质量控制、过滤和去除双胞，共获得了33,572个细胞和28,511个基因，鉴定出18种不同的细胞类型。研究人员进一步分别计算GF和SPF小鼠脾脏的细胞比例，确定了微生物群对免疫细胞类型比例的影响。
图1 单细胞图谱显示GF和SPF小鼠脾脏的细胞组成
考虑到GF和SPF小鼠脾脏表型的显著差异，研究人员分别对脾脏中的B和T免疫细胞类型进行单细胞亚聚类分析（图2），确定了7种B细胞亚型和9种T细胞亚型，并揭示了这两种免疫细胞亚型的不同基因表达模式和功能，这些差异可能是由共生微生物群引起的。此外，研究人员发现GF和SPF小鼠的血浆（Jchain）和iTreg（Ctla4）亚群的空间分布是不同的。
图2 B细胞和T细胞免疫亚型的亚聚类分析
2.GF和SPF小鼠脾脏的空间分层结构
为了全面了解脾脏的空间结构，研究人员对GF和SPF小鼠进行BayesSpace空间聚类（图3），根据脾组织学和解剖学，将GF和SPF小鼠空间聚类到相同的6个簇中，并用典型的标记基因来鉴定各个区域[红髓区（red pulp, RP）； 边缘区（marginal zone, MZ）；白髓区（white pulp，WP）]对应的细胞类型，发现SPF和GF小鼠脾脏的结构明显不同，且GF小鼠微生物群缺失导致脾脏WP免疫细胞结构紊乱。
研究人员对每个区域进行GO富集分析，阐明了脾脏不同区域的不同功能的分子基础，并强调了微生物群对脾脏功能的影响。
图3 SPF和GF小鼠的脾脏空间结构
结合单细胞和空间转录组数据集，研究人员进一步研究微生物群对脾脏亚结构的影响（图4）。结果显示，SPF小鼠脾脏中的4种免疫细胞类型的空间分布具有清晰的层次结构，包括Marco（MZ巨噬细胞）、Cr2（MZB细胞）、Ighd （滤泡B细胞）和Cd3d（T细胞），它们均以明确的层次从外到内分布，而GF小鼠的细胞在MZ区和WP区的排列明显较分散和紊乱。研究人员使用单细胞带有注释结果的数据集分别对GF和SPF小鼠的空间切片进行解卷积，证实了缺乏共生微生物群会导致脾脏WP和MZ区的结构紊乱，并导致适应性免疫反应能力减弱。
图4 微生物群对小鼠脾脏亚结构的影响
3. 微生物群可能通过影响趋化因子的表达来影响脾脏结构
研究人员通过分析四大趋化因子家族（Cxcl、Ccl；Cxcr、Ccr）在GF和SPF小鼠各细胞类型中的表达情况（图5），发现微生物群可能通过调节趋化因子的表达来影响脾脏的结构组成。趋化因子Ccr7和Cxcl13的空间分布模式和细胞分布水平惊人地一致，Cxcl13围绕着WP区的Ccr7。Cxcl2和Cxcr2对GF小鼠中的嗜中性粒细胞发挥强大的趋化作用，而Cxcl9和Cxcl10是仅在SPF小鼠中表达的干扰素-γ相关细胞因子。Ccr6和Ccr7在SPF小鼠中的表达水平高于GF小鼠。Ccl19在SPF小鼠中的T细胞区域累积，而在GF小鼠中没有。
此外，研究人员通过进一步系统分析GF和SPF小鼠之间细胞-细胞相互作用的差异，证实了以上的发现，即SF和SPF小鼠脾脏结构的差异与趋化因子有关。
图5 SPF和GF小鼠scRNA-seq数据集中趋化因子的不同表达
总结
脾脏在人体对细菌和真菌感染的免疫反应中起着至关重要的作用。本研究中，研究人员基于华大自主研发的时空组学技术Stereo-seq和DNBelab C4单细胞测序平台，全面研究了SPF和GF小鼠脾脏中的B细胞和T细胞亚型，鉴定了9种T细胞亚型和7种B细胞亚型。基因差异表达分析显示，微生物群的缺失导致红髓区红细胞生成的改变和白髓区的先天性免疫缺陷。
此外，研究人员在SPF小鼠的脾脏中发现了MZB细胞、MZ巨噬细胞、滤泡B细胞和T细胞的层次结构，而在GF小鼠中观察到这种层次结构是无序的。这种层次结构的破坏可能是由于微生物群对趋化因子表达的调节而导致的。这些发现对于理解微生物群在调节脾脏功能中的关键作用具有重要意义，并为免疫相关疾病的潜在新治疗策略提供了见解。
作者：张银
