时空组学FAQ_时空组学常见问答_时空组学资源_STOmics

Q 透化时间不同的样本，可以同时上机吗？展开收起

A

可以。透化时间的设置范围为0-30 min，精度可达小数点后一位（如16.5 min）。上机前仅需将每个样本的透化时间与芯片号正确对应填写，并根据系统提示，将芯片按照透化时间由短到长的顺序放入芯片槽即可。同行芯片如透化时间不同，时间差需≥3 min，跨行芯片如透化时间不同，时间差需≥4.5 min。

Q STOmics 透化测试实验中拍照的结果如何分析? 展开收起

A

透化测试的主要作用是判断组织样本的适用性以及摸索组织样本的透化条件。荧光拍照时需要统一曝光时间、亮度和对比度，在统一拍照结束以后，为了更直观地判断不同透化时间组织样本的荧光拍照表现，建议使用 imageJ软件进行处理。

处理方法：将拍好的不同透化时间的图片统一拖入 lmage J 软件，在菜单栏中选择Image -> Stacks -> Stack to lmages(也可以按快捷键 F2合并)，点击 OK 合并图片后，就可以统一调整图片参数。在菜单栏选择 Image -> Adiust->Brightness/Contrast，可以直接按 Auto 自动调整统一的参数。按键盘的左右键可以切换图片。如果不满意 Auto 调整的结果，可以按 Reset 重置参数，手动进行调整，直至选到对比明显的一组参数。选取组织轮廓最清晰，荧光信号最强的拍照结果的条件作为最佳透化条件，得到的透化条件可以是一段时间范围，如 9-12 min。

Q 时空蛋白转录组Stereo-CITE的优势是什么？展开收起

A

Stereo-CITE是基于测序的空间原位捕获技术，具有500 nm级分辨率，可以在同一切片上实现转录组和蛋白组的共检测，可检测蛋白重数为100+。利用强大的多组学分析工具，通过空间条形码(Coordinate lD，CID)还原回空间位置，生成单细胞或亚细胞级基因和蛋白表达图谱。

Q 目前的产品适配哪些抗体panel？可以兼容多少重蛋白检测？是什么类型的抗体？这些蛋白靶点主要是什么研究领域的？展开收起

A

可以使用已预混好的商品化混合抗体进行时空蛋白转录组实验，检测重数100+。目前产品针对小鼠样本，可检测119个靶点，推荐抗体为TotalSeq™-A Mouse Universal Cocktail, V1.0 (Biolegend, Cat. No.199901，119重抗体+9重同型对照)；针对人的样本，可检测154个靶点，推荐抗体为TotalSeq™-A Human Universal Cocktail, V1.0(Biolegend, Cat. No.399907，154重抗体+9重同型对照)。

也支持自由选择TotalSeq™-A 抗体组合为感兴趣的Panel。

测试后兼容的一抗均为Biolegend公司的TotalSeq™-A系列，二抗均为Thermo Fisher Scientific公司的Alexa Fluor™ Plus系列。

蛋白靶点主要围绕免疫治疗、肿瘤微环境探索、发育机制研究等领域开发。

Q 时空蛋白转录组匹配的生信分析软件版本号分别是什么？如果目前使用的版本号比推荐版本号低，是否需要更新？展开收起

A

时空蛋白转录组适配的软件版本号分别为：lmageStudio≥V3.0.3，SAW≥V7.1.0，StereoMap≥V3.1.1。如果您的软件当前版本低于推荐版本号，需要先升级到对应版本后，再进行分析。

Q 时空转录组文库和ADT文库是否要分开建库？其测序策略是什么？如果需要加测，应如何测序？展开收起

A

是的，两种文库要分开建库。为了保证测序时的碱基平衡，需要将带有不同Sample Barcode的ADT文库与转录组文库共同测序。建议将拟混合测序的ADT和转录组文库先各自制备DNB后，按照DNB的浓度，将ADT文库与转录组文库DNB按照1:1质量比混合，按预计总产出1.5-2G reads上机测序。测序类型为50+100+10。如果老师您自行测序，建议使用DNBSEQ-T7进行测序，不推荐MGISEQ-2000。

当下机数据不足需要加测时，要求用PE100测序试剂，蛋白组和转录组可共同测序，任一蛋白组可和任一转录组混合搭配测序，无需搭配同一样本的蛋白组或转录组。

Q 在玻片上画疏水圈的注意事项有哪些？展开收起

A

1. 组织固定结束0.1X SSC浸泡后，立即用无尘纸擦干组织外周一圈，并画上疏水圈。这样操作可使组织内湿润但组织外周干燥，方便画疏水圈。

2. 画疏水圈时，将玻片放在免疫组化湿盒内，用手按住玻片后再画疏水圈，避免玻片移动。

3. 加液时要加在疏水圈内，液体覆盖住整个组织即可。液体过多则容易溢出疏水圈，存在疏水圈难以封住液面的风险。

4. 吸弃液体时，先平着吸走液体，再微微倾斜载玻片吸液。

Q 如果抗体存在研发已测试Biolegend TotalSeqA单抗体列表中，客户是否需要做相关验证实验？展开收起

A

如果存在于该抗体列表中，为了获得较好实验结果，建议您先按照我们推荐的浓度（1:250）在同一样本中进行IF预实验，也可按照已有经验做抗体浓度测试以及自由组合测试，待验证工作浓度起作用后，再开展正式实验。如果不存在于该列表中，需要您按照已有经验先做抗体滴定实验以及自由组合测试，待确认最佳抗体浓度后，再正式开展全流程实验。

Q 样本先用PFA固定，再用OCT包埋后，是否可以用于时空蛋白转录组实验？展开收起

A

不可以。时空蛋白转录组实验流程目前只适用于新鲜包埋样本，暂不兼容PFA样本。采用的是贴片后4% PFA试剂在时空蛋白转录组实验中的作用是用于组织切片贴片后的固定步骤。

Q 针对组织透化实验过程中出现脱片现象，有什么改善方案吗？可否提供相关操作说明？展开收起

A

针对容易脱片样本，透化实验过程中可选甘油封片的操作，具体请参考以下步骤操作

1.组织切片与烤片

a. 将组织切片贴到芯片上后，37℃烤片时间延长至10 min；

2.组织固定

a. 烤片结束后，立即将芯片载体置于− 20℃预冷的甲醇中，确保甲醇浸没载体上的所有芯片，固定50 min;

b. 固定结束后，将玻片盒或50 mL 离心管转移至通风橱中；

c. 将载体从玻片盒或50 mL 离心管中取出，用无尘纸吸干载玻片背面和芯片周围多余的甲醇，确保无液体残留；

d. 将载体竖立放在载玻片染色架上，置于通风橱中晾干4-6 min，让甲醇充分挥发；

e. 甲醇挥发完全后，肉眼可见组织变白，将载体转移至实验桌上。

3.甘油封片

a. Glycerol 使用前离心，用移液器缓慢吸取5 μL Glycerol 甘油滴加到组织中央，避免产生气泡；

b. 用镊子夹取盖玻片，小心将盖玻片的一端放在芯片边上，同时握住另一端，然后逐渐将盖玻片放低到芯片上直至完全覆盖芯片；待甘油浸润整张芯片后，静置10 min 以上。

c. 静置结束后，用镊子将盖玻片轻轻推至载玻片边缘，夹住盖玻片一角，用镊子轻轻地平行移动盖玻片，直到芯片与盖玻片完全分离；

d. 将载体置于装有30 mL 0.1X SSC 的50 mL 离心管中浸泡3-5 s；

e. 取出载玻片，用无尘纸擦去载玻片背面及芯片四周的残液，确保无液体残留。

后续操作按照《Stereo-seq透化试剂套装（载体版）使用说明书》（说明书版本号：D）“3.5. 透化时间测试”章节继续。

备注说明：若是在透化实验中该方法有改善组织脱片的效果，在转录组实验中，可以使用本方案中的烤片时间以及固定时间替代《Stereo-seq转录试剂套装（载体版）使用说明书》（说明书版本号：D）中对应操作的时间。