甲醇固定的原理是甲醇脱水,沉淀蛋白质从而形成分子间交联,固定组织状态和RNA相对位置。甲醇预冷时间限制的原因是:(1)时间过短,甲醇未达到-20°C,会影响组织mRNA质量;(2)甲醇预冷时间过长,若盛放容器密闭性很好,则不影响固定效果;若容器密闭性差,则甲醇会吸收空气中的水分,导致浓度下降影响固定效果。
OCT是聚乙二醇和聚乙烯醇水溶性混合物,具有粘合剂的作用,37℃条件下烤片,OCT由固态变为液态,可增加组织切片与芯片的贴合程度,降低脱片风险。另外,甲醇固定在-20℃条件下进行,如果不烤片,贴片后立刻固定,没有温差的作用,增加脱片风险。
烤片过程中在光线明亮处观察,切片有裂痕、空腔皆会显示出芯片的底色,比成功覆盖上组织的部位更黑。烤片结束,组织和OCT中的水分挥发完全后,贴有组织处呈现白色。
冷贴与热贴各有优缺点,可根据个人习惯选择。冷贴便于大尺寸芯片贴片,不容易产生气泡,可以调整组织在芯片上的位置,利于展片。热贴不需要预冷芯片,相对冷贴,减少了芯片和组织切片移动带来的风险,一般适用于相对平整的小组织切片。此外,若需要在同一芯片载体上贴两个组织样本切片,建议使用热贴,详细操作可参考试剂盒使用说明书。
已经结霜的芯片拿出来烤干,后续尽量避免长时间预冷导致结霜,若操作不能很好控制时间,请不要放在温度很低的地方。此外,还需注意不要将芯片长时间放在切片机开口正下方,否则冷热空气在开口处交汇更易产生冰霜。
不同组织或同一组织不同区域,其细胞大小各有差异,目前按照一般尺寸单层细胞计算大多数样本建议厚度是10 μm。过薄增加切片难度,相对厚切片而言,基因捕获量降低;过厚有脱片的风险。对于不同物种,我们做过的切片厚度范围在5-30 μm之间,您可以根据具体情况测试优化后选择。
请从以下三点确认:(1)样品托与样品发生松动。此情况可把样品托取下,将包埋块重新固定在样品托上;(2)样品托后有杂质。请取下样品托清理后重新安装;(3)可能两张切片时间间隔过久,组织表面温差发生改变导致厚度有些微差异。建议合理进行切片安排。
样品中的冰晶主要有两种情况:1. 组织内部的冰晶,组织内的冰晶主要是组织块降温不够迅速,导致组织内的水分凝结成冰晶。可以从两方面来降低发生概率:(1)可以把组织切小一些(满足实验需求即可),使组织内部降温时间变短;(2)组织放入OCT后进行干冰速冻时,尽可能将包埋盒四周放置在干冰中,加快降温速度可以减少冰晶产生;大块的组织推荐使用乙醇浴来降温。2. 组织外的冰晶,通常是组织清洗带来的液体没有擦干导致,这种情况可不对组织进行清洗。
过量的OCT会影响RNA提取和RNA质检的结果。在组织包埋过程中,过量的OCT还会挤压组织致使形变,特别是小组织样本。因此建议组织包埋只取适量的OCT,在切片质检时可以修去多余的OCT。
推荐使用Agilent 2100。Agilent 2100是大多技术普遍应用和公认的标准,灵敏度高,只需1 μL(0.1-50 ng/μL)的RNA即可。