细胞分割的效果受到显微镜拍照的情况和分割算法等多重因素的影响。拍照时如果存在组织过曝、模糊等因素，会影响算法识别细胞，导致无法分割。对于密集区域本身清晰度不够，并且可能存在细胞重叠的情况，那么也会导致算法难以识别。如果图像中组织不同区域局部亮度不均匀、或者存在实验导致的拖尾、背景存在杂质等情况，也会导致分割错误。（部分示例见下方）详细信息请查阅《Stereo-seq 空间多组学技术成像指南》。
从算法本身来讲，因为分析流程的自动分割算法是基于人工标注的数据集，学习训练而来，所以一些非常少见的细胞形态未能涵盖进数据集中，也可能会导致算法无法准确识别出细胞。
如果自动算法分割效果不佳，可以尝试使用 StereoMap 桌面端图像处理软件进行手动调整，也可以尝试用其他算法重新分割，将分割后的 .tif格式的二进制细胞掩膜文件重新导入 StereoMap 做后续分析。详细操作请查阅《StereoMap 用户手册》>图像处理指南>核染色图像>#第四步：细胞分割。
注：每个染色类型推荐的分割算法可参考：CellBinDB：大规模多模态数据集助力细胞分割模型开发与评估
请登录时空组学官网：https://www.stomics.tech/products/BioinfoTools/OfflineSoftware/SAWOperationManual下载查阅SAW详细说明书，GitHub链接：https://github.com/STOmics/SAW。
SAW >= 8.0：
使用预封装的pipeline进行分析，使用方式请查阅《SAW 用户手册》。
SAW < 8.0：
请登录时空组学官网：https://www.stomics.tech/products/BioinfoTools/OfflineSoftware/SAWOperationManual 下载查阅SAW详细说明书。
GitHub链接：https://github.com/STOmics/SAW。
第一步：检查HTML报告中Valid CID Reads的比例是否正常，如低于30%请确认测序FASTQ文件和芯片SN对应；
第二步：检查Clean Reads下的比例：
（1）参考基因组格式异常：Multi-Mapped Reads比例高， Uniquely Mapped Reads比例很低且几乎全部注释失败，需要检查注释使用的GTF/GFF文件是否符合格式要求，是否可以通过检测程序；
（2）存在混样的可能性：需要自行排查实验部分；
HTML报告中的饱和度分析可评价测序数据的整体质量，为提高计算效率，在指定bin size维度下从成功注释reads中进行小样本随机抽样，故同一数据多次运行的结果可能略有区别，但曲线整体形态一致。
图1：随机抽样数量增加，bin200维度下的基因中位数逐渐增加。
图2：根据随机抽样样本的Unique Reads数据拟合而出的曲线。
图3：对抽样样本中的Unique Reads(CID、gene和MID都唯一的reads)进行统计，饱和度值=1-(Unique Reads)/(Total Annotated Reads)，随着抽样量增加，拟合曲线近平缓代表数据趋于饱和，是否加测需根据项目整体设计和样品情况而定，例如珍贵样品建议可加测。
注：三张图片的x轴相同，y轴分为基因中位数、Unique Reads和饱和度值
StereoMap 是一款零代码桌面软件，集 Stereo-seq 数据交互式可视化与图像处理于一体。内置 Image QC 工具可自动检测数据质量，Image Processing 模块支持手动配准、智能圈选等功能，精准修复异常图像，助力高效分析。详细信息见《StereoMap 用户手册》。
注：ImageStudio 已合入 StereoMap (≥4.0)。
此功能的使用需根据SAW版本进行区分。
Option1：使用C++编译的 geftools：
1. https://github.com/BGIResearch/geftools
Option2：使用python包 gefpy：
1. https://pypi.org/project/gefpy/
2. https://gefpy.readthedocs.io/en/latest/index.html
3. pip install gefpy==0.6.1
Option3：如已安装SAW sif（如v5.1.3）：
1. https://hub.docker.com/repository/docker/stomics/saw
2. singularity exec SAW_v5.1.3.sif cellCut
3. 请使用singularity 3.8及以上版本
Bash |
MID（Molecular ID）即分子编码，实验过程中每个mRNA分子带有唯一的MID，用于区分来源于不同mRNA分子的PCR扩增子。MID（即UMI）代表每个基因在每个分析单元中检测到的转录本数目。
主要目的是去除杂质，因为试剂中含有杂质，所以要离心。按照试剂盒使用说明书操作即可。
FcR主要封闭非特异性抗原结合的位点，如果不封闭，会与目标抗原非特异性结合而影响目标位点的判断。请登录BioLegend 官网查询是否有针对猴的，或者咨询一下抗体公司。
主要目的有：（1）确保选择的抗体适配于时空组学的mIF实验，可表达出正确的pattern；（2）根据滴定实验可以判断最佳的抗体浓度。
