Q
纯化后的cDNA产物浓度低如何处理?
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A
可能是组织过小，或实验过程中发生脱片，或实验失败导致。解决方案：（1) 原产物加PCR循环数；（2）同时对磁珠进行再次回溶，根据组织大小或脱片情况确认是否直接增加PCR循环数。纯化后先检测产物浓度及片段分布，再确认是否需要上机测序。
Q
实验室怎么避免RNA酶的影响？
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A
实验室洁净度达到RNA实验室的要求。实验前用酒精消毒实验桌、RNA酶去除剂喷洒器材及桌面，实验时使用含RI的试剂，实验操作时常用酒精消毒乳胶手套等都可以减少RNA酶影响。
Q
ssDNA染色的原理及作用？
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A
实验中使用的是Qubit ssDNA染料，可以特异染色单链DNA，也会非特异着色单链RNA和双链DNA，因此该染料可以对细胞核及芯片表面探针着色，可被FITC通道荧光激发，使组织形貌及Track线清晰可见，用于后续的图像-RNA表达矩阵配准。
Q
转录组实验中的反转录步骤使用的引物是随机引物吗？
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Q
转录组实验中，组织去除不干净对结果有影响吗？应该怎么处理？
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A
目前的测试结果显示组织未去除干净是不会影响实验结果的。若未去除干净，可参照转录组使用说明书用0.1X SSC轻轻吸打，去除残余组织。
Q
小鼠为mCherry荧光报告基因小鼠，将进行各组织的空间转录组测测序，能否在常规操作（H&E染色及测序）的基础上实现荧光扫片？
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A
自带mCherry荧光的样本，需要确认下荧光通道的波长范围，建议与FITC、TRITC通道波长范围相距较远，不容易相互干扰。可以提前将组织贴在玻片上测试一下是否存在相互干扰。
Q
如何在实验操作过程中避免图像配准拼接问题？
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A
图像拼接准确的前提是拍照图片质量够高，拍照过程需要注意以下要点：（1）正确摆放芯片，减小倾斜角；（2）拍摄中尽量避免显微镜晃动，减少因震动产生的拼接问题；（3）熟练掌握拍照操作方法，清晰拍摄组织Track线，清晰的FOV数量越多，图像质量越好，拼接效果越好。
Q
拍照时间是否有要求？
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A
通常情况1 cm × 1 cm芯片拍照时间10 min左右，大尺寸芯片拍照时间最长不超过40 min。
Q
甘油封片产生气泡，导致拍摄的组织ssDNA图像也存在气泡，这种情况是否会影响生信分析？是否需要重新进行甘油封片？
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A
组织内部的气泡杂质并不影响转录组的捕获效果，可以继续后续实验步骤，但是有以下几点需要考虑：（1）气泡会影响后续数据分析圈组织或者细胞的精度，导致生信分析结果不准，但可以通过手动调整来解决；（2）是否有发文章、对图片美观程度的需求；（3）若气泡所占面积比较小，且不是在您所关注的区域，则不用在意气泡的影响。
目前不建议重新封片，我们没有测试过二次封片是否对实验结果有影响。
Q
转录组实验为什么需要甘油封片？5 μL甘油若不能覆盖整张芯片，应如何操作？
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A
甘油封片的成像效果更佳。标准实验流程5 μL能够覆盖完全芯片，若未覆盖可按以下操作：（1）可以适当从芯片和盖玻片缝隙、甘油未覆盖处加一些甘油（1-2 μL），可以达到完全覆盖的效果；（2）如果甘油在盖玻片一侧溢出，另一侧甘油没有完全覆盖芯片，可以考虑轻微挪动盖玻片，保证整张芯片覆盖完全甘油（存在剐蹭组织风险，对操作要求高）。
