Q
时空转录组FF的样本测序数据量有推荐吗？
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测序数据量与芯片大小、物种、组织类型、研究目的有关，组织类型不同，捕获量也有差异。
时空转录组FF V1.3不同尺寸芯片的数据量可参考如下公式：推荐测序数据量 = 组织长(mm) × 组织宽(mm) × 10000 × 3000，其中10000是将组织面积转换为bin20个数的系数，3000是每个bin20平均需要测到的reads条数。
您可以根据测序数据是否满足分析需求再决定是否加测，具体测序数据量请参考研究目的调整。
Q
cDNA产物最长保存多久还能上机测序？
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cDNA文库是PCR后的双链DNA，-20℃环境下，稳定性较高。目前经验是1个月内均可。
Q
实验室怎么避免RNA酶的影响？
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实验室洁净度达到RNA实验室的要求。实验前用酒精消毒实验桌、RNA酶去除剂喷洒器材及桌面，实验时使用含RI的试剂，实验操作时常用酒精消毒乳胶手套等都可以减少RNA酶影响。
Q
ssDNA染色的原理及作用？
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A
实验中使用的是Qubit ssDNA染料，可以特异染色单链DNA，也会非特异着色单链RNA和双链DNA，因此该染料可以对细胞核及芯片表面探针着色，可被FITC通道荧光激发，使组织形貌及Track线清晰可见，用于后续的图像-RNA表达矩阵配准。
Q
转录组实验中，组织去除不干净对结果有影响吗？应该怎么处理？
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目前的测试结果显示组织未去除干净是不会影响实验结果的。若未去除干净，可参照《时空转录组FF V1.3转录组实验操作说明书》用0.1X SSC轻轻吸打，去除残余组织。
Q
小鼠为mCherry荧光报告基因小鼠，将进行各组织的空间转录组测测序，能否在常规操作（H&E染色及测序）的基础上实现荧光扫片？
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自带mCherry荧光的样本，需要确认下荧光通道的波长范围，建议与FITC、TRITC通道波长范围相距较远，不容易相互干扰。可以提前将组织贴在玻片上测试一下是否存在相互干扰。
Q
如何在实验操作过程中避免图像配准拼接不准的问题？
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图像拼接准确的前提是拍照图片质量够高，拍照过程需要注意以下要点：
（1）正确摆放芯片，减小倾斜角；
（2）拍摄中尽量避免显微镜晃动，减少因震动产生的拼接问题；
（3）熟练掌握拍照操作方法，清晰拍摄组织Track线，清晰的FOV数量越多，图像质量越好，拼接效果越好。
Q
甘油封片产生气泡，导致拍摄的组织ssDNA图像也存在气泡，这种情况是否会影响生信分析？是否需要重新进行甘油封片？
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组织内部的气泡杂质并不影响转录组的捕获效果，可以继续后续实验步骤，但是有以下几点需要考虑：
（1）气泡会影响后续数据分析圈组织或者细胞的精度，导致生信分析结果不准，但可以通过手动调整来解决；
（2）是否有发文章、对图片美观程度的需求；
（3）若气泡所占面积比较小，且不是在您所关注的区域，则不用在意气泡的影响。
目前不建议重新封片，我们没有测试过二次封片是否对实验结果有影响。
Q
转录组实验为什么需要甘油封片？甘油若不能覆盖整张芯片，应如何操作？
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甘油封片的成像效果更佳。若甘油未完全覆盖整张芯片可按以下操作：（1）可以适当从芯片和盖玻片缝隙、甘油未覆盖处加一些甘油（1-2 μL），可以达到完全覆盖的效果；（2）如果甘油在盖玻片一侧溢出，另一侧甘油没有完全覆盖芯片，可以考虑轻微挪动盖玻片，保证整张芯片覆盖完全甘油（存在剐蹭组织风险，对操作要求高）。
Q
组织荧光染色液是染细胞膜还是细胞核的染料？有没有染细胞膜的染料？例如橙色的Dil、绿色的 Dio、红色的DiD、红色的Alexa Fluor 555 Phalloidin等。
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A
组织荧光染液为细胞核染液。
目前暂时没有成熟可用的细胞膜染料。橙色的Dil、绿色的 Dio、红色的DiD、红色的Alexa Fluor 555 Phalloidin这些染料都需要测试，确认是否可以准确识别细胞边界，是否影响时空芯片的捕获。
