时空组学FAQ_时空组学常见问答_时空组学资源_STOmics

Q 同样是10x物镜，为什么我的图会过大/过小，导致过不了QC？显微镜的实际放大倍率及QC算法可接受的范围是什么？展开收起

A

显微镜的物镜标识的放大倍率由于各种原因，可能和实际倍率有出入，导致显微镜成像的图不是真实的10x。而StereoMap 小工具模块的图像 QC 算法在倍率差异过大的时候会更容易出现误判或错误检测，因此出现类似问题的时候需要检查显微镜相机的实际放大倍率情况是否符合要求。
StereoMap 小工具模块的图像 QC 算法可接受的实际放大倍率的范围为：[0.28 ~1 ] 微米/像素（µm/pixel）。通过以下步骤，获取必要信息。
手动获取。拍摄一个芯片，已知芯片的规格为1 cm * 1 cm，使用imageJ选择芯片的宽度获得图像中的芯片pixel数，理论宽度 (µm) / 实际测量宽度 (pixel)，得到放大倍率。
如果您的实际放大倍率不在算法可以接受的范围内：建议首先确认下选择的物镜放大倍率是否是 10X，其次可以跟显微镜工程师联系做调整。
理论上一个S1芯片的宽度为1 cm。如示意，实际测量芯片宽度为20065.36 pixel，实际放大倍率Scale = 1 cm / 20065.36 pixel = 10,000 µm / 20065.36 pixel = 0.498 µm/pixel。
0.498 µm/pixel在QC算法可接受的实际放大倍率Scale[0.28 ~1 ] 微米/像素（µm/pixel）范围内。

Q Stereo-seq分析的图像处理流程整体是什么样的？展开收起

A

此功能的使用需根据软件版本进行区分

SAW >= 8.0, StereoMap >= 4.0

图像配准(含预配准)->组织分割->细胞分割->细胞修正->矩阵提取

Stereo-seq_image_processing_overview_v2

SAW < 8.0, StereoMap < 4.0, ImageStudio <= 3.0

图像预配准->组织分割->细胞分割->图像配准->细胞修正->矩阵提取

Stereo-seq_image_processing_overview_v1

Q Bin是方形区域还是指圆形区域？分析时如何选择合适的Binsize？展开收起

A

- Bin是芯片上规整的N × N的方形区域，区域内表达信息汇总就是Bin的表达信息，注意不包含正方最右侧边和最下方边的DNB点（Bin1除外）。

- 可以按照不同组织类型的细胞大小等，根据下游分析效果多次调试Bin20、50、100、200数值。其中Bin20与动物细胞大小近似，Bin50和Bin100是常用于分析的Binsize大小，Bin200一般用于快速可视化效果展示。

image (41)

Q 如何进行特定bin size表达矩阵的聚类分析？展开收起

A

此功能的使用需根据SAW版本进行区分

SAW >= 8.0:

SAW >= 8.0 不再需要使用stereoPipeline.sh脚本分析，
可使用SAW reanalyze cluster 流程，设置参数--bin-size进行指定bin size的聚类分析。
详细使用操作请查看《SAW 用户手册》>使用教程>数据再分析>#聚类分析部分。

SAW < 8.0：

可通过spatialCluster模块中的-s参数设置不同的binsize选择，但需注意SAW直接输出的聚类结果默认只支持Bin200的结果展示，仅作为一个大致的参考。如果要进行更精确的聚类，推荐您使用Stereopy进行下游分析，这部分分析是在SAW之外的。

Q SAW中两个配准模块register和rapid Register的区别是什么？展开收起

A

此功能模块只在SAW < 8.0存在。SAW register有细胞分割的步骤，而rapidRegister没有。

Q 为什么自动配准后存在翻转问题？展开收起

A

组织的显微镜拍照图片和基因空间表达矩阵进行配准时会存在翻转问题，而翻转情况和芯片规格对应的测序方案以及显微镜的图像输出相关。

技术背景：

① 芯片测序坐标系：芯片测序原点（0，0）位于左下角，而图像的坐标原点和可视化的原点在左上角，因此系统自动处理图像和表达矩阵配准时会默认进行翻转，使坐标系对齐。

② 显微镜镜像：部分显微镜软件输出图像时可能存在水平/垂直镜像。如果叠加默认的翻转，将会导致双重坐标变换，导致配准错误。

如何提前判断自己的显微镜输出的图像是否需要在QC/分析前翻转呢？

① Stereo-seq的技术使用芯片进行捕获，而芯片是不透光的，所以无论正置或倒置显微镜，显微镜拍摄组织染色图都是需要镜头正对组织进行拍照，与人眼面对组织时看到的方向一致。

② 因此获取显微镜图像时只要确认，人眼看到的芯片上的组织方向，与显微镜软件输出图像中的组织方向一致，无镜像，就可以确认配准后不会出现翻转问题。

③ 同时，如果组织贴片时在芯片上呈现轴对称形态，或者空间矩阵与影像图特征相似度低（比如局部低表达），SAW自动配准在这种场景下容易误判配准旋转角度。为了规避这种误判，可以选择使用StereoMap Image Processing里的Feature Point配准方式，此时需要确保输出图像方向与芯片手柄朝右时的组织方向一致。

如果判断显微镜输出图像和组织在芯片上的方向存在镜像，有什么解决方案呢？

① 调整显微镜系统设置，关闭可能存在的镜像输出选项。

② 或使用PhotoShop、ImageJ等图像处理软件对图像进行翻转后，再进行QC。

翻转问题CN

20231017-153833

Q ImageQC/ImageStudio、SAW、StereoMap的版本匹配关系展开收起

A

请参考《SAW 用户手册》>适配兼容的软件和试剂盒，或《StereoMap 用户手册》>适配兼容的软件和试剂盒，获取最新信息。

imageQC	ImageQC描述	SAW	SAW描述
<= 1.0.8	文件格式：.json + .tar.gz 描述：ssDNA图像QC	<= 4.1.0	支持组织分割和ssDNA图像配准
>= 1.1.0	文件格式：.ipr + .tar.gz 描述：ssDNA图像QC	>= 5.1.3	支持ssDNA图像细胞分割；支持Q4 FASTQ数据分析
ImageStudio	ImageStudio描述	SAW	SAW描述	StereoMap	StereoMap描述
1.0	文件格式：.ipr + .tar.gz 描述：ssDNA图像QC及手动处理	>= 5.5	支持ssDNA图像细胞分割；支持Q4 FASTQ数据分析；	1.0	支持空间表达热图展示；基因分布merge展示；ssDNA图展示及手动配准；
2.0	文件格式：.ipr + .tar.gz 描述：ssDNA、DAPI、mIF图像QC及手动处理	>= 6.0	支持mIF配准；支持rRNA过滤	2.0	mIF图展示；mIF图merge展示；
2.1	文件格式：.ipr + .tar.gz 描述：ssDNA、DAPI、mIF图像QC及手动处理；及QC失败图像的全手动处理；	>= 6.1 < 7.0	支持ImageStudio全手动处理图像接入流程；	2.1 < 3.0	支持多GEF一次性读入，通过切换标签展示
2.2	文件格式：.ipr + .tar.gz 描述：ssDNA、DAPI、mIF图像QC及手动处理；及QC失败图像的全手动处理；	>= 6.1 < 7.0	支持ImageStudio全手动处理图像接入流程；	2.1 < 3.0	支持多GEF一次性读入，通过切换标签展示
3.0	文件格式：.ipr + .tar.gz 描述：ssDNA、DAPI、H&E、mIF图像QC及手动处理；及QC失败图像的全手动处理；	7.0	count重构上线 register重构，升级组织分割和细胞分割V03算法。支持H&E全流程处理支持基于细胞分割的mask图像结果，使用EDM算法进行细胞修正。	3.0	支持读入不同binsize/resolution的h5ad；CGEF文件跑过SAW cellChunk模块后写入/codedCellBlock信息，加载CGEF时支持渲染cellbin热图
（已与StereoMap合并）	文件格式：.tar.gz（包含.ipr）描述：ssDNA、DAPI、H&E、mIF图像QC及手动处理；及QC失败图像的全手动处理；	8.0	使用pipeline进行分析支持FFPE样本分析（包含微生物部分）输出报告压缩包文件输出可视化压缩包文件	4.0	图像可视化：支持使用.stereo统领文件读取；兼容旧版本数据读取手动处理：使用step by step方式处理图像数据
（已与StereoMap合并）		8.1	支持Stereo-seq T FF V1.3和Stereo-CITE T FF 样本分析	4.1	图像可视化：支持展示 cellbin 的单/多基因热图；支持蛋白&Marker 基因的多组学联动展示。手动处理：增加空芯片打点配准（无需矩阵）；输出文件支持用户自定义目录。

Q 时空蛋白转录组Stereo-CITE 产品方案只能检测膜表面蛋白吗，能否检测胞内蛋白？展开收起

A

时空蛋白转录组 Stereo-CITE 产品方案并非仅能检测膜表面蛋白。经研发测试验证，只要具备适配的蛋白抗体，无论是膜蛋白还是胞内蛋白，均可实现有效检测。

Q SAW中对测序数据做了哪些过滤？展开收起

A

CID过滤：过滤CID无法比对上mask文件的reads；
MID过滤：过滤MID序列中含有N碱基的reads，过滤含有至少一个以上质量值低于10的碱基的reads；
reads过滤：过滤含有DNB序列的reads；过滤去除接头后长度小于30bp的reads；过滤去除Poly-A后长度小于30bp的reads。

详细信息请查看《SAW 用户手册》算法原理>Read processing algorithms。

Q 华大时空组学技术Stereo-seq配套的线下分析软件ImageQC/Imagestudio、SAW以及StereoMap 使用时有哪些注意事项？展开收起

A

需要注意：一、新版本软件可兼容旧版本功能；二、三个软件必须配套使用，即软件的不同版本号之间需要配套。现有不同版本号间的配套规则如下：

imageQC	ImageQC描述	SAW	SAW描述
<= 1.0.8	文件格式：.json + .tar.gz描述：ssDNA图像QC	<= 4.1.0	支持组织分割和ssDNA图像配准
>= 1.1.0	文件格式：.ipr + .tar.gz描述：ssDNA图像QC	>= 5.1.3	支持ssDNA图像细胞分割；支持Q4 FASTQ数据分析
ImageStudio	ImageStudio描述	SAW	SAW描述	StereoMap	StereoMap描述
1.0	文件格式：.ipr + .tar.gz描述：ssDNA图像QC及手动处理	>= 5.5	支持ssDNA图像细胞分割；支持Q4 FASTQ数据分析；	1	支持空间表达热图展示；基因分布megre展示；ssDNA图展示及手动配准；
2.0	文件格式：.ipr + .tar.gz描述：ssDNA、DAPI、mIF图像QC及手动处理	>= 6.0	支持mIF配准；支持rRNA过滤	2	mIF图展示；mIF图merge展示；
2.1	文件格式：.ipr + .tar.gz描述：ssDNA、DAPI、mIF图像QC及手动处理；及QC失败图像的全手动处理；	>= 6.1< 7.0	支持ImageStudio全手动处理图像接入流程；	2.1< 3.0	支持多gef一次性读入，通过切换标签展示
2.2	文件格式：.ipr + .tar.gz描述：ssDNA、DAPI、mIF图像QC及手动处理；及QC失败图像的全手动处理；	>= 6.1< 7.0	支持ImageStudio全手动处理图像接入流程；	2.1< 3.0	支持多gef一次性读入，通过切换标签展示
3.0	文件格式：.ipr + .tar.gz描述：ssDNA、DAPI、H&E、mIF图像QC及手动处理；及QC失败图像的全手动处理；	7	count重构上线register重构，升级组织分割和细胞分割V03算法。支持H&E全流程处理支持基于细胞分割的mask图像结果，使用EDM算法进行细胞修正。	<=3.0	支持读入不同binsize/resolution的h5ad；cgef文件跑过SAW cellChunk模块后写入/codedCellBlock信息，加载cgef时支持渲染cellbin热图
3.0		7.1	支持时空蛋白试剂盒分析，可获得蛋白表达矩阵支持蛋白组和转录组联合分析	3.1	支持蛋白+转录试剂盒分析结果可视化支持主副窗分别展示不同组学，或分别展示热图和聚类图支持主副窗联动展示
已与StereoMap合并	文件格式：.tar.gz（包含.ipr）描述：ssDNA、DAPI、H&E、mIF图像QC及手动处理，以及QC失败图像的全手动处理；	8.0	使用pipeline进行分析；支持FFPE样本分析（包含微生物部分）；输出报告压缩包文件输出可视化压缩包文件；	4.0	图像可视化：支持使用.stereo统领文件读取；兼容旧版本数据读取；手动处理：使用step by step方式处理图像数据
已与StereoMap合并		8.1	支持Stereo-seq T FF V1.3和Stereo-CITE T FF 样本分析	4.1	图像可视化：支持展示 Cellbin 的单/多基因热图；支持蛋白&Marker 基因的多组学联动展示；手动处理：增加空芯片打点配准（无需矩阵）；输出文件支持用户自定义目录。