深圳华大生命科学研究院联合南方科技大学等单位，基于华大自主研发的高分辨率时空组学技术Stereo-seq，构建了模式生物果蝇的晚期胚胎和幼虫的3D时空发育图谱，鉴定了发育中果蝇中肠的空间亚区，解析了幼虫精巢细胞命运的转变，揭示了果蝇发育过程中潜在的空间转录因子调控网络。该文章在2022年5月4日作为专辑文章之一发表于Developmental Cell，以下是第一作者王明月博士的详细解读。
文章题目：High-resolution 3D spatiotemporal transcriptomic maps of developing Drosophila embryosand larvae
发表时间：2022年5月4日
发表期刊：Developmental Cell
主要研究团队：深圳华大生命科学研究院、南方科技大学团队等
影响因子：12.270
DOI：10.1016/j.devcel.2022.04.006
研究背景
果蝇是遗传学及发育生物学等领域的经典模式生物。相比其他生物而言，果蝇的基因组相对较小、冗余少，且与哺乳动物高度保守，因此是研究胚胎发生、细胞信号转导、疾病发生机制等的常用模型。空间基因表达模式是理解复杂信号通路和细胞间相互作用的关键，而在组织发育和疾病发生等高度动态的生命活动中，追踪基因表达的时空变化是至关重要的。但因为果蝇胚胎和组织相对较小，限制了现有技术手段的应用，因此果蝇的时空基因表达图谱仍有待进一步完善。
研究样本
w1118 野生型果蝇，收集其晚期胚胎（产卵后14~16h和16~18h，分别称为E14~16和E16~18）和幼虫3个发育阶段（L1~L3）。
研究策略
收集果蝇样本的连续切片进行时空组学技术Stereo-seq测序。研究人员通过生物信息学分析，构建了果蝇晚期胚胎及幼虫期的三维转录本模型，鉴定了果蝇主要器官的功能亚区。并通过探究果蝇精子发生过程中关键基因的空间动力学机制，绘制了果蝇发育的空间转录调控网络。
研究结果
1. 完善BDGP数据库中果蝇基因表达空间位置信息
研究人员将使用Stereo-seq获取的基因空间表达图谱（图1）与BDGP数据库（Berkeley Drosophila Genome Project; Tomancak et al., 2002,2007）中已知的基因原位杂交结果进行比较分析，发现Stereo-seq所捕获到的基因与BDGP中该基因表达的解剖结构注释信息高度一致，表明Stereo-seq能准确地反映果蝇晚期胚胎的空间基因表达（图2A、2B）。此外，研究人员还发现Stereo-seq捕获到了大量BDGP原位杂交数据库中未能包含的基因空间位置信息，且这些基因的表达模式能够在晚期胚胎的重复样本中检测到（图2C）。因此，Stereo-seq能够高通量地捕获到高质量的果蝇晚期胚胎和幼虫的转录本表达信息，并填充了BDGP原位杂交数据库的空白。
图1 果蝇晚期胚胎和幼虫的二维空间转录组
图2 果蝇空间基因表达与BDGP原位杂交结果的比较
2. 果蝇胚胎和幼虫空间转录组的三维重构
研究人员收集了果蝇胚胎晚期及幼虫期共5个阶段的样本的所有冷冻切片进行Stereo-seq测序，并开发了一个用于样本三维重构的流程。研究人员首先在测序矩阵中提取样本每一切片的二维区域，并根据样本切片的形状及转录本的相似性进行三维上的配准，经质控、聚类、注释后，得到了该样本的三维重建模型（图3A）。此外，研究人员对重构出的三维果蝇模型进行校验，发现模型结构与已知的果蝇解剖结构高度吻合，对应组织的标记基因与先验研究结果一致。
图3 果蝇晚期胚胎及幼虫的三维重构
3. 果蝇晚期胚胎及幼虫中肠亚区的鉴定
在果蝇的三维模型中，基于亚聚类和标记基因鉴定，研究人员发现代表前肠和中肠等复杂组织的三维聚类可以进一步细分为更精确的亚区。通过整合单细胞基因表达图谱和其他多模态数据（如空间位置信息）识别相关基因模块，研究人员鉴定了5个发育阶段的样本中空间不同、功能不同的基因模块，并发现随着生物体的成熟，编码蛋白质或淀粉消化所需的糜蛋白酶、胰蛋白酶和淀粉酶的基因家族的表达水平在胚胎和幼虫发育过程中增加（图4A、4B）。最后研究人员将这些基因模块在三维重建的中肠模型中可视化，观察到样品在每个阶段沿消化道分布3~4个不同的模块，且编码消化酶的基因呈现出不同的空间和时间动态模式（图4C、4D）。这一发现揭示了果蝇发育过程中消化道功能基因的动态的时空特征，并为深入研究胚胎发生过程中中肠区域的变化提供了线索。
图4 果蝇胚胎及幼虫中肠的空间亚分区
4. 果蝇幼虫精巢细胞的时空状态分析
为了探究果蝇体内细胞状态及其转化，研究人员使用三龄（L3）幼虫精巢的横切面进行亚聚类和空间基因表达分析。通过整合Stereo-seq空间转录组数据以及scRNA-seq数据集，鉴定了精子发生过程中的各种细胞类型，包括不同阶段的精原细胞和初级精母细胞（图5A~5C）。通过RNA速率分析（图5D），绘制了幼虫精巢中精子发生的空间转录动力图谱。研究人员还对具有高空间速度的基因进行拟时分析及富集分析（图5E~5G），构建了从精原细胞到早期初级精母细胞再到晚期初级精母细胞的时空动力模型。
图5 果蝇幼虫精巢细胞亚型及细胞状态的转变
5. 果蝇发育过程中基因时空调控网络的构建
为了探究果蝇发育过程中基因的空间调控，研究人员使用SCENIC（single-cell regulatory network inference and clustering）分析了空间转录组数据中转录因子（transriptionfactors，TFs）的空间活性（图6），如中枢神经系统中的Rbp6、脂肪体中的srp等转录因子与原位杂交结果高度吻合，并揭示了部分未知转录因子（中枢神经系统特异性CG16779）的潜在调控活性。
图6 果蝇胚胎及幼虫中关键转录因子的空间活性图谱
总结
这项研究，利用华大自主研发的高分辨率、高灵敏度的时空组学技术Stereo-seq，分析了发育过程中果蝇转录组的时空变化，证明了Stereo-seq数据可用于果蝇晚期胚胎和幼虫的空间转录组的三维重建。通过进一步分析，研究人员确定了果蝇晚期胚胎和幼虫中肠的功能亚区，揭示了幼虫精巢的时空细胞状态动力学变化，并揭示了转录因子在空间中已知的和潜在的调控机制。这些研究和发现提供了全面详实的数据和信息资源，为深入和系统进行果蝇发育生物学研究奠定基础。
本研究中提供的数据：
Stereo-seq数据集获取网址：https://db.cngb.org/search/project/CNP0002189.
作者：王明月
