6月19日，Cell Research发表了上海复旦大学附属中山医院与华大集团共建的“中华精准医学中心”、华大生命科学研究院和复旦大学附属中山医院等单位合作的研究成果。该研究基于华大自主研发的时空组学技术Stereo-seq和单细胞建库平台DNBelab C4，系统研究肿瘤组织（tumor tissues，T）、肿瘤边缘区域（tumor margin areas，M）、肿瘤旁组织（paratumor tissues，P），以及正常或转移性淋巴结（lymph nodes，LN）的细胞组成和转录特征，全面描述了肝癌中500 µm浸润区独特的局部生态系统，并确定肿瘤细胞、免疫细胞和肝细胞之间存在活跃的串扰，这可能有助于开发肝癌和其他实体瘤的新治疗策略。以下是文章的详细解读。

• 文章题目：An Invasive Zone in Human Liver Cancer Identified by Stereo-seq Promotes Hepatocyte–Tumor Cell Crosstalk, Local Immunosuppression and Tumor Progression

• 发表时间：2023-06-19

• 发表期刊：Cell Research

• 主要研究团队：中华精准医学中心、深圳华大生命科学研究院、西南华大生命科学研究院、杭州华大生命科学研究院和复旦大学附属中山医院等

• 影响因子：46.297

• DOI：10.1038/s41422-023-00831-1

- 研究背景 -

实体肿瘤是具有高度异质性的复杂生态系统，其中涉及癌细胞与各种细胞类型（包括免疫细胞、基质细胞和细胞外基质）的相互作用。解剖肿瘤生态系统，尤其是肿瘤边缘周围的生态系统，可以深入理解肿瘤细胞的浸润和侵袭机制，对于探索肿瘤转移机制和开发有效的新疗法也至关重要。

肝癌，包括肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）和肝内胆管细胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC），是一些最常见和最具有侵袭性的肿瘤类型，由于治疗选择有限且效果不理想，全球肝癌发病率和死亡率都很高。本研究中，研究人员利用Stereo-seq和scRNA-seq联合分析，揭示了人类肝癌肿瘤侵袭前沿特征，为开发肝癌和其他实体肿瘤的新治疗策略铺平了道路。

- 研究样本 -

Stereo-seq：21例病理诊断为原发性肝癌的患者（6例HCC，15例ICC）中的53份新鲜或新鲜冷冻样本（包括12份T，21份M，10份P，10份LN），共计98张切片。

scRNA-seq：5例原发性肝癌患者（1例HCC，4例ICC）的16份样本（5份T，5份M，2份P，4份LN）。

- 研究成果 -

1. 人类原发性肝癌四个组织区域的空间转录异质性

为了系统地表征人类肝癌的复杂转录结构，研究人员使用具有纳米级分辨率（直径 220 nm/spot）和厘米级全景视场（10 mm×10 mm）的时空组学技术Stereo-seq，分析来自肝癌患者的新鲜或新鲜冷冻T、P、M，以及正常或转移性LN样本，同时结合基于单细胞建库平台DNBelab C4的scRNA-seq技术，获得了33,111个单细胞的转录组数据，并将其与公开发布的ICC scRNA-seq数据集进行整合，建立一个无偏参考图谱，以定义Stereo-seq切片中不同细胞群的细胞类型（图1a）。

以scRNA-seq数据为参考，利用SPOTlight计算组织切片中每个点（bin 50）的细胞成分，共注释得到了9种主要细胞类型：B细胞、浆细胞、巨噬细胞、树突状细胞、肝细胞、内皮细胞、成纤维细胞，以及其他两种细胞类型（肿瘤细胞和胆管细胞合并为一种主要细胞类型；T细胞和NK细胞合并为一种主要细胞类型）（图1b）。

图1 人类原发性肝癌中多个区域位点的空间转录组图谱

肝癌中四个区域（T、M、P和LN）的细胞组成和空间分布具有高度异质性，除主要的肿瘤细胞和肝细胞外，T/NK细胞、B细胞和成纤维细胞是最丰富的细胞（图2a）。根据病理学家基于相邻H&E染色图像确定的肿瘤边界，边缘区域在空间上分为边缘区域的肿瘤相邻部分 (tumor-adjacent part of margin areas，M-T) 和肿瘤旁部分 (paratumor part of margin areas，M-P)。

研究人员观察到，肿瘤组织中的内皮细胞和浆细胞多于其他区域，而成纤维细胞和巨噬细胞倾向于富集在M-T而不是肿瘤组织，B细胞在 LNs中最丰富；与P相比，M-P富集了更多的成纤维细胞（图2b）。在空间上，巨噬细胞等免疫细胞主要富集在肿瘤边界的边缘区域，表明肿瘤边界周围存在独特的免疫微环境（图2a、2c）。

图2 肝癌患者组织的空间异质性

为了研究不同肿瘤区域的微环境，研究人员对组织区域进行分割（1000 bins×1000 bins或每个spot 500 µm×500 µm，bin1000），以获取局部bulk RNA图谱作为一个微环境单元，每张切片上约有400个单元，共获得39,200个单位。结果显示，M可能是一个复杂的区域，其特征是微环境缺氧、炎症反应强烈和免疫逃逸率高（图2d）。

2. 沿肿瘤侵袭边界区域的切线和法线方向的特征

为了全面剖析肝癌肿瘤侵袭边界区域的局部微环境，研究人员利用一种新的分割方法，即扫描数字化模型（scanning and digitization model，SDM），来进一步研究肿瘤侵袭边界区域两侧的特征（图3a），观察到不同的局部空间肿瘤微环境（tumor microenvironments，TMEs）特征：肿瘤侵袭边界周围存在免疫抑制微环境，免疫细胞显著富集，包括距离肿瘤侧边界第一层（0~250 µm）的巨噬细胞（特别是M2-like表型）、T/NK细胞、树突状细胞（dendritic cells，DCs）和B细胞（图3b~3f）。

研究人员进一步表征肿瘤侵袭边界区域肿瘤细胞和其他细胞成分（主要是肝细胞）中癌症标志物的存在和代谢变化，确定了一个独特的侵袭区域（以肿瘤边界两侧为中心的500 µm宽的区域），并定义为“侵袭前沿”。侵袭前沿具有免疫抑制环境占主导地位、脂肪酸代谢能量供应增加、肿瘤细胞上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）能力增强，以及肝细胞严重受损的特点（图3f、3g）。

图3 侵袭区域的特点是免疫抑制微环境、肿瘤细胞的代谢重编程和严重受损的肝细胞

为了分析沿肿瘤侵袭边界可能存在的空间异质性，研究人员进一步分析了侵袭区沿边界切线方向的细胞多样性和状态，发现与亚区域其他细胞组成模式（模式1：成纤维细胞为主；模式2：成纤维细胞和巨噬细胞为主；模式4：B细胞和T/NK细胞为主；模式5：内皮细胞为主）相比，肿瘤复发患者中显著富集模式3（巨噬细胞为主），提示浸润区域中巨噬细胞可能是肿瘤进展的关键因素（图3h~3j）。

3. 侵袭区JAK-STAT3激活诱导受损肝细胞亚型SAAs的高表达

为进一步表征肝细胞的炎症反应及这种反应在肿瘤侵袭中的作用，研究人员将来自肿瘤旁侧三层（0~250 µm、250~500 µm和500~750 µm区域）的肝细胞重新聚类，鉴定了两种肝细胞亚型（Hep1和Hep2），其中Hep1表现出更高的SAA1和SAA2（血清淀粉样蛋白A1和A2；统称为SAAs）表达水平，并显著富集在最靠近肿瘤旁边界的 250 µm宽区域内（图4a、4b）。研究人员通过进一步分析组织切片中接近Hep1富集区域和其余区域的肿瘤细胞之间的差异基因表达，确认肝癌肿瘤细胞可以通过分泌CXCL6并随后在侵袭区激活JAK-STAT3通路来诱导肝细胞中 SAAs的过表达（图4f~4l）。

图4 侵袭区JAK-STAT3激活诱导高表达SAAs的肝细胞的区域特异性损伤

4. SAAs⁺肝细胞亚型有助于巨噬细胞的募集和M2极化

为了探索侵袭区中SAAs⁺肝细胞（Hep1）的功能，研究人员基于边缘区域的scRNA-seq数据，使用CellPhoneDB观察配体-受体对来分析细胞-细胞相互作用，发现在肝细胞和巨噬细胞之间观察到最强的双向通讯，有超过25个显著相互作用的配体-受体对（图5a）。表达SAAs受体编码基因（FPR1、FPR2、TLR4、TLR2、SCARB1和CD36）的巨噬细胞在空间上富集在侵袭区Hep1亚型细胞附近，进一步的定量分析显示，SAAs受体+巨噬细胞在第一层（距肿瘤边界0~250 µm）肿瘤侧富集，这支持了侵袭区受损肝细胞通过分泌SAAs来募集巨噬细胞（图5b~5f）。

图5 受损肝细胞中CXCR2与侵袭区CXCL6⁺肿瘤细胞间相互作用诱导SAAs高表达

使用scRNA-seq数据对配体-受体相互作用的分析进一步表明，侵袭区的肝细胞和巨噬细胞也可以通过SAAs-TLR2相互作用，这已被证明可以使巨噬细胞极化为M2样表型（图5b）。此外，肿瘤细胞还可以通过侵袭区的CSF1-CSF1R或CSF1-SIRPA相互作用，直接使巨噬细胞极化为M2样表型（图6a）。侵袭区巨噬细胞表现出M2样表型，CD163、MRC1和SAAs受体TLR2表达上调，而肿瘤组织中巨噬细胞表现出细胞外基质重塑特征，MMP9和MMP14表达上调（图6b）。

图6 侵袭区受损肝细胞高表达SAAs促进肝脏肿瘤进展

5. SAAs⁺肝细胞亚型与肿瘤进展相关

接下来，研究人员探讨了受损肝细胞和侵袭区募集的巨噬细胞的临床意义。结果显示，侵袭区高比例的SAAs⁺肝细胞与原发性肝癌和继发性肝癌患者的不良预后显著相关（图6c、6d）。为验证是否能通过调控SAAs的表达来控制肿瘤细胞的进展和侵袭，研究人员利用小鼠原位肝癌和肠癌肝转移模型，在体内特异性转染以降低正常肝细胞的SAAs表达，发现可以减少侵袭区巨噬细胞富集程度，同时肿瘤生长也得以延缓（图6e~6i）。

上述表明，巨噬细胞通过侵袭区受损肝细胞分泌SAAs被特异性募集并极化为M2表型（图7）。这导致了局部微环境的免疫抑制增强，并促进了肿瘤的进展。Saas的敲除抑制了肿瘤的生长，表明SAAs抑制可能是原发性和继发性肝癌的潜在治疗策略。

图7 肿瘤侵袭前沿区的细胞互作及促侵袭/转移机制

-  总   结  -

本研究中，研究人员联合Stereo-seq和scRNA-seq，首次解析了肝癌肿瘤细胞侵袭正常肝细胞过程中的交界线周围区域的细胞组成、分子特征及交互作用，确定并描述了一个以肿瘤边界为中心的独特的、500 μm宽的“侵袭前沿”。该侵袭前沿包含一个复杂而动态的局部肿瘤生态系统，可以决定肿瘤侵袭的风险和患者的预后。此外，该研究证实了SDM方法可用于探索肿瘤生态系统，以表征癌症中存在的空间异质性，这为开发肝癌和其他实体瘤的更精确、更有效的治疗方法奠定了基础。

本研究由上海复旦大学附属中山医院与华大集团共建的“中•华精准医学中心”、深圳华大生命科学研究院、西南华大生命科学研究院、杭州华大生命科学研究院、复旦大学附属中山医院等多个科研团队共同完成。吴靓、闫加艳、白寅琪、陈霏雨、邹轩轩、许江山和黄傲为该论文的共同第一作者，周俭、陈奥、杨欣荣和刘石平为论文的共同通讯作者。

本研究严格遵照伦理规范开展，相关数据已完成中国人类遗传资源信息开放使用备案。

内容 | Lina

审校 | 吴靓、邹轩轩