心脏传导系统（cardiac conduction system，CCS）通过启动和协调心脏的兴奋和收缩，在心脏生理功能中起着至关重要的作用。CCS的发育异常会导致心律失常，包括心动过速（如Wolff-Parkinson White综合征）和心动过缓（病态窦房结综合征和房室传导阻滞）。深入了解CCS在发育过程中的形态发生和成熟以及细胞类型异质性的生理机制，对于理解这些节律性疾病的发病机制至关重要。然而，目前对不同类型的细胞何时以及如何形成CCS的不同组成部分的理解仍然有限。

儿茶酚胺是一种典型的交感神经递质，被认为是心脏发育必不可少的关键因素。然而，儿茶酚胺的来源和其对CCS发育的真正重要性仍然不确定。由于CCS的形态发生和成熟的复杂性以及对其有限的理解，回答以上问题需要能够同时分析心脏整体的空间基因表达模式，而不受细胞异质性的偏倚影响。

因此，该研究利用时空组学技术Stereo-seq结合scRNA-seq和谱系追踪，以期探索CCS发育过程中的细胞和分子机制。

利用Stereo-seq和scRNA-seq技术，分别分析在特定时间点E12.5、E14.5、P3和P56，以及E8.5、E10.5、E12.5、E14.5、E16.5和P3采集的小鼠胚胎或心脏组织样本。

1. 小鼠心脏中Dbh⁺儿茶酚胺能心肌细胞群的鉴定

研究人员利用scRNA-seq结合Stereo-seq（图1a），对发育中的小鼠心脏细胞类型进行研究，绘制了小鼠心脏的单细胞时空转录组图谱，提供了心脏传导系统（cardiac conduction system，CCS）的全景视野。

研究人员发现心脏发育过程中存在多种细胞类型，包括早期胚胎组织、混合非心肌组织以及心室和心房的心肌细胞群，并进一步重点分析了心肌细胞群（cardiomyocytes，CMs）。通过使用PHATE降维和无监督聚类，单细胞数据共识别了15种CMs的细胞类型。

该分析揭示了CMs从中胚层心肌祖细胞到更成熟的发育过程，其中可以观察到CCS的细胞类型单独成群（图1b，图1d）。此外，本研究首次在心肌细胞类型中鉴定出一群表达Dbh基因的细胞（图1c）。

图1 利用scRNA-seq鉴定小鼠Dbh⁺心肌细胞群

类似于scRNA-seq，Stereo-seq分析可以鉴定出心肌细胞及非心肌细胞（图2b），且证实E12.5至P3阶段的工作CMs和非工作CMs中均存在Dbh⁺的表达（图2c）。另外，Stereo-seq显示Dbh在心室传导系统中高表达，且其与心室传导系统相关的标记物共定位，进一步证明Dbh与发育中的CCS存在相关性。

总体来说，该研究将Stereo-seq与scRNA-seq相结合，构建了心脏发育不同阶段的转录组图谱，首次鉴定出一群表达Dbh基因的心肌细胞并提出其与CCS发育具有相关性。

图2 利用纳米级分辨率的Stereo-seq揭示Dbh在发育中心脏的动态表达

2. 谱系追踪及RNAscope证实Dbh⁺-CMs和Dbh⁺细胞衍生的CMs存在于发育中的CCS

为进一步证实Stereo-seq分析的结果，研究人员建立了三种不同的小鼠遗传模型：Dbh^Cre/Rosa26-tdTomato，Dbh-Knockin-CFP（Dbh^CFP）和Dbh^CreERT/Rosa26-tdTomato诱导谱系。通过RNAscope、免疫荧光染色、confocal成像及3D图像重构等技术绘制遗传命运图谱（genetic fate mapping），对心脏发育过程中CMs的细胞谱系和细胞命运进行追踪。

研究发现，发育的CCS中存在Dbh⁺-CMs和Dbh⁺细胞衍生的CMs（图3）。研究人员利用多重核酸原位杂交（multiplexed nucleic acid in situ hybridization）RNAscope证实了发育中CCS的特定区域存在Dbh⁺的表达，这种空间共定位证明了Dbh⁺-CMs存在于发育中的CCS。

为了进一步阐明Dbh⁺细胞衍生的CMs在出生后和成年小鼠心脏中的空间解剖特征和基因表达模式，研究人员对心脏进行了成像和3D计算图像重建。3D模型显示了Dbh⁺细胞衍生的CMs在CCS中的空间分布特征（图4e，f），与Stereo-seq的分析结果一致。通过分析这些空间分布特征，研究人员发现，Dbh⁺-CMs在CCS的房室结和希氏-浦肯野传导系统中均有分布，Dbh⁺细胞衍生的CMs形成了浦肯野传导细胞以外的CMs（与之前的转录组分析结果一致，图1c，图2c，d，图4c）。

研究人员特别强调了Dbh⁺-CMs和Dbh⁺细胞衍生的CMs在CCS中的生理作用，特别是在希氏束（HIS）和浦肯野氏纤维（PKJ）中发现Dbh⁺细胞衍生的CMs与Cx40⁺细胞共存（图5）。总之，这些发现提供了强有力的证据，进一步强调了Dbh⁺-CMs和Dbh⁺细胞衍生的CMs参与CCS的建立和功能。

3. 电生理学实验证明Dbh⁺-CMs和Dbh⁺细胞衍生的CMs为心脏传导系统的功能组成部分

为了阐明Dbh⁺-CMs和Dbh⁺细胞衍生的CMs在成年小鼠心脏中的生理功能，研究人员开展了心脏的光遗传学电生理研究，发现光刺激诱导的Dbh-ChR2和Cx40-ChR2心脏的电生理特征基本相似，且使用鲁哥试剂处理对心室浦肯野纤维进行化学消融的实验，进一步证明了Dbh⁺细胞衍生的CMs与浦肯野纤维的联系类似于Cx40衍生的肌细胞与浦肯野纤维的联系（图6）。

为进一步了解Dbh⁺-CMs在心脏生理学中的作用机制，研究人员建立了心肌细胞特异性敲除Dbh的小鼠模型Dbh^cko和对照小鼠模型Dbh^f/f，通过在体及离体的心脏电生理学特征比较，首次证明Dbh基因的心肌细胞特异性缺失会影响CCS的电生理特性（图7）。

4. Dbh⁺-CMs的儿茶酚胺能特征鉴定

为了利用体外实验确定Dbh⁺-CMs中Dbh表达的作用，研究人员通过透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）成像和能量色散X射线谱（energy dispersive X-ray spectroscopy，EDS）分析，利用儿茶酚胺颗粒特异性铬染色试剂对组织进行固定和成像，并使用肾上腺髓质嗜铬细胞作为阳性对照。结果显示富含Dbh⁺-CMs的房室交界处，尤其是起搏细胞，存在具有铬信号的高电子密度囊泡，证明了儿茶酚胺的存在，提示Dbh⁺-CMs具有儿茶酚胺分泌功能（图8）。

图8 透射电子显微镜显示CMs内的儿茶酚胺能囊泡

该研究利用Stereo-seq结合scRNA-seq，首次发现和鉴定了一群特定的Dbh⁺儿茶酚胺能心肌细胞群，确定了这一特定细胞群的空间分布和细胞功能，揭示了其在发育及成熟小鼠心脏传导系统结构和功能中的作用，加深了对心脏传导机制的理解，并为进一步研究心血管生物学及其对心脏疾病和心律失常的潜在影响奠定了基础。