肿瘤免疫治疗的最新突破突出了肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）的重要性，在肝癌TME的复杂环境中，肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAF）通过重塑细胞外基质（extracellular matrix，EM），与调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）和抑制性髓系细胞相互作用，并促进HCC中的上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），影响肿瘤的进展和转移。

以前对CAF亚群的研究强调了它们在不同癌症类型中的异质性。然而，HCC中CAF的特征、功能、空间结构和独特的细胞间相互作用仍有待探索。癌症的特征之一是癌细胞的表型可塑性，即肿瘤细胞重编程为具有胚胎特征的癌症干细胞。考虑到CAF、肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）和内皮细胞（endothelial cells，ECs）之间的相互作用在肿瘤进展中的关键作用，该研究探索了CAF亚群在HCC中的胚胎特征。

使用华大自主研发的时空组学技术Stereo-seq，结合流式细胞术、多重RNA-荧光原位杂交实验等方法，分析了HCC患者的肝癌组织及其癌旁正常组织，以及胎肝组织样本。利用已发表的scRNA-seq数据，构建了HCC的单细胞图谱。

为描述HCC的TME景观，研究人员整合了来自6个已发表数据集的scRNA-seq数据，构建了一个HCC单细胞图谱（其中包括来自83名供者的251,761个细胞，图1a，b）。考虑到CAF在肿瘤进展和复发中的重要作用，研究人员进一步描述了HCC CAF的异质性。通过重新聚类6,163个间质细胞，描绘了9个亚群（图1b），并分别指出了不同亚群的特征。

图1b HCC单细胞图谱

考虑到数据整合过程中不可避免的偏差，研究人员仅使用Sharma_2020数据集（包括14名HCC患者的肿瘤及其癌旁正常组织），通过对1,712个间质细胞的非监督聚类，产生了9个类群（图2a，b），同样也分析了胎肝间质细胞的异质性（图2c，d），揭示了HCC和胎肝间质谱系的复杂性和异质性，为进一步探究CAF亚型是否同样具有胎肝相关特征鉴定了基础。

图2 (a, b, c, d). HCC和胎肝中“癌-胚”CAF的单细胞图谱

最近的研究已表明了HCC的TME发生了类似于胚胎的重编程现象，然而CAF是否会经历类似的过程？研究人员整合了来自肝癌组织、癌旁正常组织、胎肝组织和健康肝组织样本的scRNA-seq数据（图2e），发现了在HCC中POSTN⁺ CAF的“癌-胚”重编程的可能性（图2f），并结合各种方法的进一步验证，揭示了肝癌中POSTN⁺ CAF的“癌-胚”重编程，表明了其在动员免疫抑制的TME方面的潜在作用。

图2 (e, f). e.正常肝组织、胎肝组织、HCC组织及其癌旁正常肝组织的单细胞图谱; f.HCC和胎肝的bar plots

2. “癌-胚”细胞间相互作用网络是“癌-胚”邻域的关键机制之一

POSTN⁺ CAF上调了血管发育和髓系激活程序，这进一步促使研究人员关注了“癌-胚”生态系统内的细胞间通信。通过NicheNet分析，研究人员观察到作为“癌-胚”调节因子的预测配体的表达在“癌-胚”细胞中也普遍上调（图3a），强调了“癌-胚”细胞类型之间的密切相互作用。值得注意的是，POSTN⁺ CAF显示出了免疫调节趋化因子的优先表达，如CCL2和CXCL12（图3b）。总之，这些数据结果揭示了“癌-胚”细胞类型之间的优先相互作用。

图3 (a, b). b. Bubble heatmap显示调节“癌-胚”细胞的优先配体的表达

3. 空间分析揭示“癌-胚”细胞类型在HCC TME中共定位于同一个生态位

鉴于“癌-胚”细胞之间的细胞间相互作用，研究人员推测这些“癌-胚”细胞共同定位以建立“癌-胚”生态位。为了证明这种可能性，研究人员基于华大自主研发的时空组学技术Stereo-seq，捕获了空间转录组信息。研究人员以bin 100分辨率（100×100 DNB，约直径50 μm)，分别从36,776和23,941个bins中追踪到HCC01和HCC03肿瘤的转录信息。

研究人员首先在空间图谱上标记了“癌-胚”细胞簇特异性的标记基因，在空间邻域bins中观察到了FOLR2、PLVAP和POSTN基因的共富集（图4a）。基于“癌-胚”特征基因的表达值，研究人员将前2.5%的bins及其周围的bins定义为“癌-胚”细胞高度表达的bins（onco-fetal cell-high bins，图4b）。对POSTN⁺ CAF特征表达的进一步评估显示，在PLVAP⁺ EC和FOLR2⁺ TAM富集的bins中，POSTN⁺ CAF（而非POSTN- CAF）具有类似的富集性和空间相关性（图4c），表明“癌-胚”细胞类型在TME中共存。

接下来，研究人员将“癌-胚”生态位（onco-fetal niche）定义为包含或被包围在所有三种“癌-胚”细胞类型（POSTN⁺  CAF、FOLR2⁺ TAM和PLVAP⁺ EC）的Stereo-seq bins。单独来看，HCC01中的“癌-胚”生态位分布在切片周围，而HCC03中的“癌-胚”生态位呈集中分布模式（图4d），可能反映了患者之间的异质性。

此外，Stereo-seq使得研究人员能够放大特定的“癌-胚”生态位，并生成更高分辨率的空间特征。通过bin 10的分辨率（10×10 DNB，约直径5 μm），即真正的单细胞分辨率，研究人员证实了“癌-胚”细胞类型的共富集及其在定义的“癌-胚”生态位（图4d中的红色区域）中的相近性。

值得注意的是，这两种肿瘤中的生态位显示出参与调节“癌-胚”生态系统的核心配体的优先表达。此外，研究人员还应用Stereo-seq数据验证了预测的配体-受体配对与生产细胞在空间上的相关性。正如预期的那样，结果证实了CXCL12-CXCR4配对的显著共定位，涉及POSTN⁺ CAF和FOLR2⁺ TAM之间的相互作用，而DLL4-NOTCH3配对涉及PLVAP⁺ EC和POSTN⁺  CAF之间的相互作用。这些结果与之前的细胞间通讯分析一致，并表明了一个系统性的“癌-胚”重编程模块。

研究人员进一步通过RNAscope实验验证了“癌-胚”生态位的存在，并观察到FOLR2和PLVAP在HCC和胎肝的POSTN⁺ CAF细胞邻域表达增加（图4e），并使用CosMx空间分子成像仪（Spatial Molecular Imager）在单细胞分辨率下对约1,000个mRNAs进行了空间分析（图4g）。利用scRNA-seq数据中定义的细胞簇的标记转移（label transfer）方法，研究人员定性和定量地证实了“癌-胚”细胞的共定位和“癌-胚”生态位的存在。

综上，这些结果清楚地表明，包括POSTN⁺ CAF、FOLR2⁺ TAMs和PLVAP+ ECs在内的“癌-胚”细胞类型在HCC TME中共定位于同一个生态位，且该生态位受多个配体协同调控。

4. “癌-胚”重编程与肿瘤的复发风险密切相关

接下来，研究人员探索了“癌-胚”细胞的存在是否会影响HCC患者的临床结果（图5）。考虑到“癌-胚”重编程代表胚胎早期发育过程，研究人员推测该过程很可能在肿瘤复发中起到关键作用。基于此设想，研究人员通过对三种“癌-胚”细胞群相对比例的加和定义了“癌-胚”得分（onco-fetal score），并发现高“癌-胚”得分（OF^hi）的患者发生术后复发的比例要显著高于低“癌-胚”得分的患者（OF^low）。

同时，研究人员发现HCC复发患者中存在着两个不同的亚型，其中一个亚型与OF^hi相关且具有上皮间质转化特征，另一个亚型则与OF^low相关且具有较强的代谢特征。总之，结合多种方法验证，研究结果提供了前所未有的对“癌-胚”重编程在HCC复发中的潜在作用的洞察，并强调了对其进行评估以用于疾病管理的必要性。

5. “癌-胚”重编程与免疫治疗响应相关

最后，研究人员探究了“癌-胚”重编程过程与患者对于联合免疫治疗响应情况之间的关系。最近在HCC中的一项研究表明，阿替唑珠单抗（atezolizumab，抗PD-L1）+贝伐单抗（bevacizumab，抗血管内皮生长因子）响应信号（atezolizumab+bevacizumab response signature，ABRS）的高表达与改善无进展生存率（progression-free survival，PFS）有关。

由此，研究人员首先在GO30140A和接受阿替唑单抗+贝伐单抗联合治疗的150名队列患者中探索了ABRS和Tregs特征之间的关联（图6a）。利用Treg特异性基因特征，研究人员证实了高表达ABRS基因的患者和应答者中Tregs的富集（图6b，c）。鉴于“癌-胚”细胞在与Tregs相互作用中的重要性，研究人员推测“癌-胚”重编程可能会影响联合治疗的临床响应。进一步研究发现，在IMbrave150和GO30140A队列中，FOLR2⁺ TAM、PLVAP⁺ ECs和POSTN⁺ CAF特征在ABRS和Tregs较高的人群中持续升高（图6d）。

图6 (a, b, c). a.bulk RNA-seq数据收集和Stereo-seq流程示意图；b.Boxplots显示高或低水平ABRS患者的Treg特征表达水平；c.Boxplots显示Treg特征在应答者和非应答者的表达水平

综上，这些结果表明，“癌-胚”重编程可能通过调节Tregs和ABRS基因的表达而在阿替唑珠单抗+贝伐单抗的临床响应中发挥作用。