近日，SingHealth杜克-新加坡国立大学学术医疗中心（Duke-NUS Medical School）联合新加坡国立癌症中心科研团队，采用华大自主研发的时空组学技术Stereo-seq，结合scRNA-seq绘制了患有罕见特发性多中心Castleman病（Idiopathic Multicentric Castleman Disease，iMCD）的同卵双胞胎病例的淋巴结单细胞空间图谱，揭示了IL-6通路信号在淋巴结内皮细胞和成纤维细胞网状细胞中的主导地位，并描述了外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）亚群的异质性，揭示了单核细胞的宿主免疫应答表型，为未来的iMCD临床评估提供了基础。
该研究相关成果2024年1月3日发表于Blood，以下是文章的详细解读。
文章题目：Single-cell landscape of idiopathic Multicentric Castleman Disease in identical twins
发表时间：2024-01-03
发表期刊：Blood
主要研究团队：新加坡国立癌症中心、SingHealth杜克-新加坡国立大学学术医疗中心（Duke-NUS Medical School）等
影响因子：20.300
DOI：10.1182/blood.2023021992
研究概览图
Castleman病是一组异质性淋巴增殖性疾病，分为单中心型（unicentric，UCD）和多中心型（multicentric，MCD）。特发性多中心Castleman病（Idiopathic Multicentric Castleman Disease，iMCD）是一种罕见的细胞因子驱动疾病，以全身炎症、全身淋巴结病和器官功能障碍为特征。
在病因学上，MCD与免疫缺陷背景下的Kaposi肉瘤疱疹病毒（Kaposi sarcoma herpesvirus）或一种病毒阴性的特发性形式（iMCD）相关。重要的是，涉及IL-6的细胞因子风暴（cytokine storm）在一些iMCD的临床病理表现中至关重要，并已将建立抗IL-6药物作为一线治疗方法。
IL-6/IL-6R位点的基因组改变、致癌信号通路、表观遗传调控因子和炎症相关基因都与iMCD有关。然而，iMCD中IL-6过度产生的细胞来源和机制尚不清楚，且对疾病易感性的遗传决定因素知之甚少，受影响的淋巴器官和循环中的免疫环境也未被深入研究。为填补这一空白，该研究通过描述同卵双胞胎中罕见发生的iMCD，提供了一个研究iMCD的基因组特征的独特模式和单细胞分辨率的空间图谱。
采用华大自主研发的时空组学技术Stereo-seq，分析了Twin-CS的淋巴结组织样本；采用scRNA-seq技术分析了双胞胎中的一例患者（Twin-CS）的淋巴结和骨髓组织样本，和受影响双胞胎及其未受影响姐妹的外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）。
1. iMCD的潜在病因—NCOA4和TRAF3的功能改变
研究人员首先描述了患有iMCD的双胞胎的不同临床过程，并在双胞胎中发现了胚系纯合子（germline homozygous）NCOA4 c.G1322A（NM_005437:exon8）和单等位基因TRAF3 c.G1504A（NM_003300:exon11）的变异。NCOA4 c.G1322A的非同义替换导致了氨基酸从甘氨酸到谷氨酸（p.G441E）的转变，而TRAF3 c.G1504A导致了从甘氨酸到精氨酸（p.G502R）的转变。这两种基因在计算模拟实验（in-silico）中都被预测为是有害的。
TRAF3是一种衔接蛋白（adaptor protein），通过阻断IL-6信号来抑制浆细胞的发育。胚系和体细胞变异都与B细胞恶性肿瘤（B-cell malignancies）和免疫紊乱综合征（immune deregulation syndromes）有关。小鼠的TRAF3缺乏被证明增强了B细胞对IL-6的应答和浆细胞的扩增。
综上，研究人员猜测NCOA4和TRAF3功能的改变可能在双胞胎的iMCD发展中发挥了作用，但该假设还需要进一步的研究验证。双胞胎的不同临床过程进一步表明，除了遗传易感性之外，还存在环境影响。
2. 单细胞空间图谱揭示IL-6通路信号在淋巴结内皮细胞和成纤维细胞网状细胞中的主导地位
研究人员通过scRNA-seq技术绘制了骨髓、淋巴结和外周血单核细胞的转录组图谱（共94,947个细胞），并将这些划分成不同的细胞集群。特别研究了与UCD和MCD有关的基因表达，以及NCOA4和TRAF3。研究人员发现IL-6通路基因（IL6，IL6ST，OSMR和LIFR）在淋巴结中占主导地位，存在于淋巴结中的不同细胞类型包括浆细胞，B细胞，T/NK细胞等（图1a）。
TRAF3和NCOA4主要在淋巴结和PBMC中，PBMC中表达IL-6通路的基因在淋巴结内皮细胞和成纤维细胞中表达最高（图1b），后者包括T细胞区成纤维细胞网状细胞（fibroblastic reticular cells，FRCs）、滤泡树突状细胞（follicular dendritic cells，FDCs）和肌成纤维细胞（myofibroblasts）（图1c）。IL-6通路基因主要在淋巴结内皮细胞和FRCs中表达（图1d）。
研究人员采用无监督空间约束聚类（unsupervised spatially-constrained clustering）方法识别了不同的解剖结构，绘制了滤泡和滤泡间区图谱。进一步采用细胞分割（cell segmentation）方法，对捕获的细胞进行过滤，得到了96,725个细胞（bin-20，直径15 μm)，平均每个细胞捕获了55个基因，并利用细胞类型特异性标记将它们注释到预期的空间区域，获得的空间分析结果与单细胞图谱结果一致，即IL-6通路基因与内皮细胞和FRCs显著共定位（图1e-h）。淋巴结组织的免疫荧光/免疫组化染色也证实了IL-6和IL-6ST与内皮细胞和FRCs共表达（图1I）。
图1 单细胞空间图谱揭示IL-6通路信号来源于淋巴结内皮细胞和成纤维细胞网状细胞
最后，研究人员探索了来自双胞胎及其姐妹研究样本的PBMC景观，发现PBMC的单细胞图谱显示出单核细胞群内的异质性，与其姐妹相反，双胞胎的单核细胞群在PBMC内的比例最大（图2a-b）。研究人员通过进一步分析单核细胞群，发现了7个由不同基因表达谱定义的亚群（图2c）。
为进一步将该发现与临床结果相结合，研究人员将Twin-CS的PBMC从疾病发作到利妥昔单抗治疗后部分缓解的时间变化绘制成了图表。在患者无症状的基线状态下，到第72周，T/NK细胞减少，单核细胞增加。随着时间的推移，研究人员观察到单核细胞群的变化，与先前鉴定的主要细胞亚群相对应。这些发现表明，外周血中不同的单核细胞应答可能为区分临床表型做出贡献。
图2 外周血中不同的单核细胞亚群分析
该研究描述了一对患有iMCD的双胞胎病例，提供了导致iMCD发生的可能证据。通过华大自主研发的时空组学技术Stereo-seq，并结合scRNA-seq，绘制了iMCD的淋巴结单细胞空间图谱，发现IL-6通路基因与内皮细胞和成纤维细胞网状细胞显著共定位，揭示了IL-6通路信号来源于血管成纤维网状细胞和内皮细胞。同时，通过对PBMC单细胞景观的进一步分析，描述了不同单核细胞的宿主免疫应答表型，为未来的研究提供了详细的临床评估基础。
SingHealth杜克-新加坡国立大学学术医疗中心Jason Yongsheng Chan、新加坡国立癌症中心Jui Wan Loh为该研究的共同第一作者；SingHealth杜克-新加坡国立大学学术医疗中心Choon Kiat Ong为该研究的通讯作者。
华大时空组学海外生态合作伙伴觅瑞（Mirxes）为本研究提供数据支持。
关于觅瑞（Mirxes）
觅瑞是一家全球领先的RNA液体活检公司，专注于血液cfRNA与cfDNA的研究。2023年9月，华大时空组学与觅瑞（Mirxes）达成合作，觅瑞成为华大时空组学STOmics海外首家生态合作伙伴。
华大时空组学将助力觅瑞构建超高通量、高分辨率的时空组学平台。该平台将放置于觅瑞在新加坡生物医学研究与开发中心Biopolis专门建造的多组学实验室中，这也将成为中国以外的首个此类平台。后续此平台将助力觅瑞与全球的科研和临床机构以及跨国药企开展合作，为科研人员提供最前沿的技术支持，为应对癌症等复杂疾病提供全新的认知，并将推动新生物标志物的发现和新靶向药物的开发。
关于新加坡国立癌症中心
新加坡国立癌症中心(NCCS)是一个领先的国家和区域性癌症中心，承接公共卫生部门大部分癌症病例，拥有岛内最多的癌症专家。
2023年9月，华大生命科学研究院、新加坡国立癌症中心及华大智造签署科研合作协议，三方将携手建设时空组学+高通量测序科研平台，推动亚洲流行癌症机理及药物反应研究。
该合作旨在利用新加坡国立癌症中心在癌症研究方面的优势，结合华大自主研发的时空组学技术Stereo-seq，以及华大智造的DNBSEQ-G400测序仪，打造超高通量、高分辨率空间组学平台，为研究人员深入探索头颈癌、卵巢癌、乳腺癌等亚洲流行癌症的病理机制提供全新维度。
内容 | 沙金
审校 | 翦敏、陈慧、黎晓玲
