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StereoMap 是什么?

StereoMap 是一个 0 代码的桌面端软件，支持 Stereo-seq 数据分析及交互式的可视化。它通过解析时空芯片测序数据中的空间条形码，还原每个生物分子在组织中的空间定位和表达水平，分析单个或者多个基因在原始切片中的分子表达，实现亚细胞分辨率的可视化，并深入发掘潜在的生物学意义。

在 Stereo-seq 数据分析工作流程中，上游及下游的分析步骤中都会用到 StereoMap。

在上游分析中，StereoMap 可以提供：图像 QC 小工具，评估图像是否可以运行 SAW 的全自动分析流程；图像处理模块，用户可以对图像做手动处理后接入 SAW 。在下游分析中，StereoMap 可以提供交互式可视化和数据探索的功能。

• 可视化指南：探索 Stereo-seq 数据的关键模块，您可以交互式地研究组织内不同 bin 或者 cell 下的特征表达分布情况。此外，它可以支持图像或多组学数据一同或并排展示，为下游分析提供更多参考信息。
• 图像处理指南：图像处理的核心模块，您可以手动将图像与表达矩阵对齐，也可以使用图画工具编辑图像的 Mask 或者导入第三方工具生成的 Mask，手动操作完成可以将手动后的文件输入到 SAW 做后续分析。
• 小工具指南： 图像处理和 Stereo-seq 数据集所需的分析小工具。
  • 图像质控- Image QC：用于评估显微镜图像的质量，确认在 SAW 中是否可以进行自动分析。

StereoMap 的输入文件

如下展示了图像处理和可视化模块需要用到的显微镜图像文件和 SAW 输出的文件。

可视化输入文件

下载并解压缩 SAW 输出的压缩包文件(visualization.tar.gz)，将会找到一个.stereo的清单文件，用户可以直接使用该清单文件打开可视化的数据，它包含了 SAW 输出的visualization.tar.gz 文件中用于可视化展示的文件路径映射信息。在使用.stereo的清单文件打开可视化的数据时，请您务必遵循如下规则：

• 默认情况下，可视化展示的所有文件与清单文件都在相同的目录路径中进行管理，强烈建议保持 SAW 输出的原始目录的文件结构。如果某个文件被移动到另一个位置或文件名已更改，请切记一定要修改清单文件中对应的文件路径。
• 可视化模块的目录中必须至少有一个基因表达（矩阵）文件（.gef）或者一个图像金字塔文件（.rpi）可用。

文件扩展名	描述
.stereo	是 JSON 格式的清单文件，包含实验信息、流程信息、基本的分析统计信息及 SAW 输出的图像和空间表达矩阵的映射信息的可视化文件。 解压 SAW 输出的压缩包文件(visualization.tar.gz)，将会找到一个.stereo的清单文件，StereoMap 支持打开 SAW 流程输出的可视化文件。
.gef	用于可视化的基因表达（矩阵）文件，是 HDF5 格式。包含每个 spot 点的每个基因的 MID 的个数。Spot 点是固定大小的正方形形状，基因在每个 spot 点的表达量在该正方形中的累计加和。默认情况下，可视化的.gef文件包含 bin1、bin5、bin10、bin20、bin50、bin100和 bin200的点。
.cellbin.gef	用于可视化的细胞特征的基因表达（矩阵）文件，是 HDF5 格式。它包含每个细胞的面积和空间位置，每个细胞中每个基因的 MID 的个数以及每个细胞所属的类群信息。在 .cellbin.gef 中，最小的单元为细胞。 仅适用于SAW运行有图的流程
.rpi	.rpi文件以金字塔形式保存多种分辨率的图像，主要为更好的做可视化展示。每一个图像被降采样多个分辨率的图层，按照 256*256 的像素进行切割并将图像碎片进行保存。若在当前分辨率下的图片尺寸小于 256ⅹ256，则无需切割。SAW 生成的rpi文件按照染色类型->图像类型->分辨率的顺序平铺展示，其中染色类型包括ssDNA、DAPI、H&E或者IF的名称，每个染色类型对应的图像类型包括配准图像、组织 Mask 和细胞 Mask，每个图像类型下对应有 bin 2、bin 10、bin 50 和 bin 100 分辨率的数据。 可以在 StereoMap 的可视化模块打开图像数据。
<SN>*.bin<N>_<leiden_res>.h5ad	.h5ad文件以 AnnData 文件格式存储空间转录组或蛋白组的聚类信息，每一个<SN>.bin<N>_<leiden_res>.h5ad的文件只允许存储一个 bin 大小的分析结果。在生成的文件中，<SN> 代表 Stereo-seq 芯片序列号，<N> 代表 bin 大小，<leiden_res> 代表 Leiden 的分群颗粒度。在 SAW 标准分析中，默认的空间聚类分析使用的 binsize 为 200，Leiden 分群颗粒度为 1.0 。如果*后接的是.protein，表示聚类结果是根据蛋白矩阵得到。
<SN>*.cellbin_<leiden_res>*.h5ad	.h5ad文件以 AnnData 文件格式存储细胞的聚类信息。在 在生成的文件中， <SN> 代表 Stereo-seq 芯片序列号，<leiden_res> 代表 Leiden 的分群颗粒度，* 表示可选内容，指是否做了细胞修正。如果* 缺失，.h5ad 文件将对应的是基于细胞核覆盖区域的特征表达矩阵的聚类结果；如果 * 被 .adjusted 替换，.h5ad 文件将记录基于细胞核修正后的特征表达矩阵的聚类结果，修正的逻辑为：在保证两个细胞不重叠的情况下，默认在原来细胞核的基础上外扩10 个像素。在 SAW 标准分析中，默认细胞聚类分析使用 1.0 的 Leiden 分群颗粒度进行处理。如果*后接的是.protein，表示聚类结果是根据蛋白矩阵得到。 SAW的标准分析流程中只有输入图像数据才会生成该文件，因细胞的位置信息是从显微镜的图像中获取的。

图像处理输入文件

SAW 嵌入了自动的图像处理算法，用于图像拼接（小图 FOV 拼接成大图）、组织分割、细胞分割及识别 Stereo-seq 芯片上的轨迹线（tracklines），可将图像与具有相同轨迹线的特征表达矩阵对齐。对于组织/细胞边界模糊或者算法无法自动检测到轨迹线的数据，可能需要您手动圈选组织/细胞轮廓或者对齐。

图像处理模块提供手动处理图像的一系列操作，主要包含手动圈选组织/细胞区域、导入第三方分割工具的Mask 结果以及手动将图像与特征表达矩阵对齐等功能。手动图像处理输入的数据包括：基于显微镜拍摄的原始 TIFF 大图图像或者运行 SAW 自动图像算法后的数据。

图像处理的预期结果可能依据输入的数据会存在差异，更多详情可参考：图像处理指南。