H&E图像

为什么要做H&E染色图像?

苏木精-伊红（Hematoxylin and eosin，H&E）染色是一种常用的组织染色，可为医学诊断提供组织学信息，被认为是金标准。苏木精主要将细胞核染成蓝紫色，而伊红主要将细胞质和细胞外基质染成不同深浅的粉红色，通过 Stereo-seq 生成的空间表达矩阵与 H&E 染色图像相结合，可以将细胞的形态与空间局部特征表达关联起来，挖掘组织切片中更多的信息。

H&E染色图像的注意事项

因 Stereo-seq 芯片是不透明的硅片，H&E 染色的图像需要用落射明场的显微镜成像，拍摄的背景颜色和轨迹线的颜色都接近为白色。与荧光灰度图像不同，H&E 染色图像通过 R-G-B 颜色的组合可以提供复杂的组织病理学信息，图像的文件大小比相同尺寸的灰度图像要大得多，故所需的计算资源也会相对较高。目前，StereoMap 在 16GB 的内存下，仅能够处理 24 位彩色、10 倍镜下1cm x 1cm 芯片的图像数据。

StereoMap 和 SAW 中处理的H&E染色图像为单张 24 位深的彩色图像。（有关更多信息，请参见 图像类型和格式 获取更多信息。）

第一步：上传图像

点击选择框中的 Choose file，选择一个兼容的图像文件或者也可以将所选文件直接拖入到选择框中，核染色图像类型仅允许上传一个图像文件。

请参考图像处理输入文件获取更详细的图像文件信息。

选择文件后会触发一个文件解析的过程，该过程不仅会读取图像，还会从输入中获取必要的信息，解析的时间会因文件类型和图像大小有所差异。在图像处理步骤，Stereo-seq 芯片序列号（SN）和显微镜配置会提供重要的参考信息，如果输入的文件是.tar.gz 或者 .stereo，信息已写入到输入文件中，可以直接开始解析。

如果输入的文件格式为.tif 或者.tiff，则需要用户输入指定的必要信息才可以做图像的解析和质控分析,一般情况下，您可以选择显微镜配置来输入有关显微镜的信息。请参阅显微镜信息配置获取更多信息。

第二步：图像配准

在该步骤中，您需要调整图像的方向、角度和尺度，以使其与空间特征表达矩阵对齐。

StereoMap 提供了两种配准方法，用于在 Stereo-seq 数据分析中对齐图像。

1. 形态学配准：根据组织形态的相似度将图像对齐。
2. 打点配准：通过标记特定的 track 点，将图像与从 Stereo-seq 芯片 SN 推导出来的 track 线模板对齐。该方法无需 SAW 生成的空间特征表达矩阵，但应考虑一些先决条件。

形态学配准

如果您在第 一步中：上传了 .stereo文件，进入第二步时，您就可以同时看到图像和空间特征表达矩阵；上传了 .tar.gz 或 .tif/.tiff 图像文件，在第二步您需要选择一个.stereo 文件来指定空间特征表达矩阵，可以点击 选择 .stereo 文件。此外，如果您在第一步上传了.stereo 文件（包含图像文件），想更改第二步展示的空间特征表达矩阵文件，您可以点击重新加载一个新的.stereo 文件，但还是使用第一步上传的.stereo文件中的图像数据。

手动配准过程包括两个阶段：根据组织形态粗略的匹配图像的方向，然后精细调整图像的位置和尺度，确保与空间特征表达矩阵完全重叠。您还可以通过 Chip trackline ，辅助进行精细对齐。

为了粗略对齐图像，您需要将显微镜图像与特征矩阵方向变换为一致。

• 使用翻转工具可以将图像绕Y轴镜像翻转。
• 点击旋转按钮使用可以将图像以相同的方向旋转。

当图像方向跟表达矩阵方向一致时，您就可以继续进行精细对齐了。

做精细配准时，您需要将图像移动到有组织覆盖的区域。

• 通过平移面板 设置移动的步长和移动的四个方向（上、下、左、右）。
• 因显微镜拍摄的图像数据的尺寸跟特征矩阵不同，您可以使用缩放工具来调整缩放的比例。

您可以勾选 Chip trackline 显示参考轨迹线模板，辅助对齐图像。此时，参考轨迹线模板可以作为矩阵的一种表示形式，如果轨迹线较暗，可以手动调整图像的归一化、对比度、亮度、不透明度和饱和度等工具按钮。

打点配准

打点配准主要是在矩阵文件未生成的情况下，利用图像上的 track 点以及预定义规则的芯片 mask 信息将图像对齐。

您需要确认图像以选择到正确的用于计算的特征点，可能会导致您的数据配准失败。如果无法达到上述要求，强烈建议您使用形态学配准的方式做后续分析。

为确保图像可以配准成功，需要您选择一个指定的点确定图像的方向，否则图像配准可能会失败。

选择特定的 track 点保证获取正确配准结果的要求如下：

1. 图像的四个边/角可以被清晰的看到。
2. 请确保按照最新的 Stereo-seq 空间多组学技术成像指南-3.2.2章节拍摄您的图像，可以从 STOmics - 文档库中访问该指南。

打点配准分为如下两个步骤：首先调整图像，确认芯片的四个边/角可以被清楚的看到。最后从已有的track点中选择某个track点将其作为参考点。

为保证图像的四个边/角可以被清晰的看到，您可以使用归一化、对比度、亮度和不透明度等工具调整图像。

看到芯片的四个角后，您需要确认靠近芯片左下角的第一个预设的 track 点，单击该点选中后，点击 Next 按钮即可完成配准。

完成配准选特征点操作后，图像的方位将会被调整，并在 Step 3 组织分割步骤展示。

第三步：组织分割

该步骤中，您需要识别组织区域，准确的识别组织边界可以减少背景干扰对于聚类结果的影响。基于图像的组织分割结果将映射到空间特征表达矩阵上，生成组织区域的表达热图。

在该步骤中，您可以编辑之前记录的组织掩膜或创建一个新的掩膜。如果是.tar.gz或.stereo文件中记录的组织掩膜将会在 Segmentation mask 下拉菜单中标记为 RECORD，而通过手动绘制或导入创建的掩膜将标记为 CUSTOM 。如需更在画布显示的掩膜图像，只需从 Segmentation mask 下拉菜单中进行选择切换即可。

如果需要编辑组织区域的掩膜图像，可以使用套索、画笔和橡皮擦等工具的组合。套索一般用于选择或剔除大面积区域，而画笔和橡皮擦工具更适合于编辑组织周围或组织中的小孔等较小的区域。

您可以通过单击右侧面板上的 Segmentation mask 下拉菜单，单击来导入第三方分割工具创建的.tif格式的二进制掩膜文件，如果对于导入的结果不满意，您可以单击来替换新的掩膜文件。

第四步：细胞分割

细胞分割是生成单细胞空间分辨率数据的核心步骤，H&E 染色的图像，可以对核区域或者细胞区域做分割。

类似于组织分割，您可以选择编辑之前已经记录的掩膜（标记为 RECORD ）或创建一个新的掩膜（标记为 CUSTOM ）。通过从 Segmentation mask 下拉菜单中切换画布中展示的掩膜。

使用套索、画笔和橡皮擦工具来编辑细胞。套索最适合用于取消大面积的背景，而画笔和橡皮擦工具更适合于较小的区域，例如标记某个细胞。

建议您使用配准后的图像导入到第三方分割工具创建.tif格式的二进制细胞掩膜文件。您可以通过单击右侧面板上的 Segmentation mask 下拉菜单，单击来导入第三方分割工具创建的.tif格式的二进制掩膜文件，如果对于导入的结果不满意，您可以单击来替换新的掩膜文件。

第五步：导出

最后是导出图像配准、组织分割和细胞分割的结果。单击 Export image processing record 将生成一个.tar.gz文件。

单击导出将打开您的资源管理器，选择保存的文件路径。

如果在第二步做了手动配准，此文件夹下会输出配准后的图像 *regist.tif ，如果您未做手动配准，该 TIFF 文件可以在 SAW 的输出目录 /outs/文件夹中找到。

.tar.gz文件包含原始的图像数据和手动处理的记录。此文件用于在SAW将图像数据和测序数据一起分析。.tar.gz文件的内部结构是固定的，不建议对其结构或者文件做任何修改。

*regist.tif文件是经过裁剪和调整的配准后的图像，跟特征表达矩阵尺寸相同。它可以在任何第三方分割工具中使用，并且生成的数据可以重新导入到 StereoMap。

手动后的图像结果 TAR.GZ 接回 SAW

手动后的图像数据有两种选择可以接回 SAW 跑后续分析。

其中一种选择为：运行SAW count流程，将手动后的图像文件.tar.gz作为--image-tar的入参。SAW count流程将 Stereo-seq 测序的 FASTQ 文件与手动后的图像文件一起分析，，并生成 HTML报告。

cd /saw/runs

saw count \
    --id=<ID> \
    --sn=<SN> \
    --omics=<OMICS> \
    --kit-version=<TEXT> \
    --sequencing-type=<TEXT> \
    --chip-mask=/path/to/chip/mask \
    --organism=<organism> \
    --tissue=<tissue> \
    --fastqs=/path/to/fastq/folders \
    --reference=/path/to/reference/folder \
    --image-tar=/path/to/image/tar

另一种选择为：运行SAW realign流程，将手动后的图像文件.tar.gz作为--realigned-image-tar的入参。SAW realign流程跳过比对步骤，基于手动后的结果文件重新生成配准后的图像数据，输出对应的矩阵文件，并生成 HTML 报告。

cd /saw/runs

saw realign \
    --id=<ID> \
    --sn=<SN> \
    --count-data=/path/to/previous/SAW/count/task/folder/id \
    --realigned-image-tar=/path/to/realigned/image/tar