图像质控-Image QC

图像质控 (Image QC) 用于评估 Stereo-seq 实验拍摄的显微镜图像是否可以在 Stereo-seq 分析流程软件包(SAW) 中准确的自动分析。

QC 入口

从 StereoMap 启动页的 Tools 进入 Image QC。

图像类型

支持的图像类型包括核染色图像（ssDNA 或 DAPI ）、一张核染色图像（DAPI）和最多六张免疫荧光图像（ IF 图像），以及彩色图像（ H&E 图像），推荐的图像文件格式是TIFF，但是我们针对部分显微镜输出的小图文件也做了适配，比如蔡司的 CZI 文件或 Motic 的小图文件。如果您不确定您的显微镜成像系统是否适用于 Stereo-seq 实验，请参考 Stereo-seq 空间多组学技术成像指南以评估您的成像系统，可以从 STOmics - 文档库中访问该指南。

数据类型

图像类型	数据类型	文件格式
核染色	8 bit /16 bit 的单通道的灰度图像推荐该数据格式	TIFF 文件 (`.tif` or `.tiff`) CZI (`.czi`)小图文件
核染色+免疫荧光	8 bit /16 bit 多张单通道的灰度图像	TIFF 文件(`.tif` or `.tiff`)
核染色+免疫荧光	8 bit /16 bit 单张多通道的灰度图像只适配了蔡司的多通道显微镜图像	CZI (`.czi`)小图文件
H&E	24 bit /48 bit 的单张彩色图像	TIFF 文件(`.tif` or `.tiff`) CZI (`.czi`)小图文件

文件格式

文件格式	显微镜型号
`.tif` or `.tiff` file	不区分
QC后的输出文件`.tar.gz`	图像质控的输出文件TAR.GZ
`.tif`格式的小图文件	Customized Motic MGI STOmics Microscope Go Optical Leica DM6 B
其它格式	`.czi` file from ZEISS Axio Scan.Z1 `.czi` file from ZEISS Axioscan 7

请查阅 QC 操作指南获取每种染色的输入数据示例。

QC 指标及标准

图像的质量直接反映了显微镜的稳定性和成像系统的优劣。图像基本的评估包括 track 线评估及拼接评估，当然可能会根据染色类型的不同，增加校准评估。每种图像的评估组合及评估标准会依据图像类型而略有不同。

评估指标包括：

Track 线评估：Track 线是刻在 Stereo-seq 芯片表面的标记线。显微镜拍摄的图像和空间特征表达矩阵都可以被检测到 track 线，可以将这两种数据模态结合起来，用于将图像跟表达矩阵的对齐。Track 线得分综合考虑了 track 线的清晰度（是否可见）及相邻 track 线的数量等因素，算法根据检测的 track 线，可以计算图像的角度、尺度和位置等并推导出图像的全局模板，以评估图像是否可以自动成功配准。
显微镜拼接稳定性：将显微镜拍摄的每个 FOV 小图拼接在一起，可以查看整个组织形态的全景图像。在图像拍摄过程中可能存在：显微镜震动或者移动、实验室台面外部干扰或者拼接算法不佳等原因，可能会导致拼接的全景图像错位，对图像的准确性和可靠性造成影响。在图像 QC 的过程中，将每个拼接好的全景图像裁成不同的 FOV，评估相邻 FOV 重叠区域祥形态特征的相似性，确定拼接效果。
校准评估：在一个芯片的多组图像数据中，每组图像的拼接、配准和组织区域范围必须保持严格的一致性才可以保证跟对应的表达矩阵对齐。由于染色条件和成像系统的限制，跟矩阵配准的图像仅在 DAPI 核染色图像中可见，因此必须保证其它 IF 图像首先跟 DAPI 图像对齐，然后使用相同的配准参数将各个图像与空间特征表达矩阵做配准，算法使用图像的相似性和特征偏移评估两张图像是否对齐。该评估指标仅适用于 DAPI+mIF 的单通道图像场景。

评估指标	分数	示例
Track线评估	≥ 60，算法检测到足够数量的合个的 track 线，图像可以与空间表达矩阵做自动配准。 < 60，算法检测到较少的 track 线或者未检测出 track线，无法推导出全局模板，您可能需要重新拍照。 QC 是否通过的必要条件。
显微镜稳定性评估（拼接评估）	≥ 60，超过 30% 的 FOV 与相邻 FOV 的重叠区域具有清晰相似的特征，并且这些 FOV 的平均特征偏移分数大于 0.7。 < 60，超过 30% 的 FOV 与相邻 FOV 的重叠区域具有模糊的特征，并且这些 FOV 的平均特征偏移分数小于 0.7。有条件的评估指标，只适用于 mIF 的小图。
校准评估	通过，核染色图像（DAPI）与另一图像(IF)之间的最大偏移量 ≤ 20 像素，且图像的形态相似度 ≥ 1%。未通过，核染色图像（DAPI）与另一图像(IF)之间的最大偏移量 > 20 像素，或者图像的形态相似度 < 1%。有条件的评估指标，只适用于mIF。

评估指标

分数

示例

Track线评估

≥ 60，算法检测到足够数量的合个的 track 线，图像可以与空间表达矩阵做自动配准。
< 60，算法检测到较少的 track 线或者未检测出 track线，无法推导出全局模板，您可能需要重新拍照。

QC 是否通过的必要条件。

显微镜稳定性评估（拼接评估）

≥ 60，超过 30% 的 FOV 与相邻 FOV 的重叠区域具有清晰相似的特征，并且这些 FOV 的平均特征偏移分数大于 0.7。
< 60，超过 30% 的 FOV 与相邻 FOV 的重叠区域具有模糊的特征，并且这些 FOV 的平均特征偏移分数小于 0.7。

有条件的评估指标，只适用于 mIF 的小图。

校准评估

通过，核染色图像（DAPI）与另一图像(IF)之间的最大偏移量 ≤ 20 像素，且图像的形态相似度 ≥ 1%。
未通过，核染色图像（DAPI）与另一图像(IF)之间的最大偏移量 > 20 像素，或者图像的形态相似度 < 1%。

有条件的评估指标，只适用于mIF。

备注：可以参考 Stereo-seq 空间多组学技术成像指南的 4.3 章节图片示例获取更多图像相关的信息。

QC 操作指南

图像 QC 的操作界面如下：

打开图像 QC 小工具，拖入待QC的文件，填写 Chip SN、Operator、Image Path 和 Staining Types 等信息，点击 Run 按钮，可开始进行图像质控的评估。

Image information	Description and example
Chip SN	【必选】 Stereo-seq 芯片序列号，可以在 Stereo-seq 芯片底部找到。 E.g. S1 (1x1) 芯片: SS200000135TL_D1, C02533C S0.5 (0.5x0.5) 芯片: FP200009107_E414, B03210C211 大芯片: S200000108BR_A3A4, D02070C3D3 请确保填写的 SN 跟实际拍摄图像的 SN 是对应的。
Operator	【必选】用户信息，建议输入拍摄人员的邮箱地址。
Image Path	【必选】待 QC 的文件目录，拖入后自动填充。建议拖入的文件路径中不能包含字母、数字和下划线以外的任何字符。
Staining Types	【必选】图像的染色类型，包括 ssDNA，DAPI，DAPI+mIF和H&E。
Upload	【必选】将图像数据上传到 STOmcis Cloud 或者用户自定义的路径，选项包括： No：不上传（默认）。 QC Input Files ：仅上传待 QC 的原始文件。 QC Output Files (TAR.GZ): 仅上传 QC 后的文件。 Select all: 上传待 QC 的原始文件及 QC 后的文件. 可以查阅上传设置获取更多信息。
Remark	【可选】输入图像或者 QC 的额外描述信息，用于记录各类不同的情况。

若拍照时已经输入芯片号和拍图人员邮箱，这两栏会自动读取芯片号和拍图人员并显示，如果内容重新填写，则将覆盖拍照时输入的内容，此功能可用于修改拍照时的填写错误。

如果您输入的图像为 TIFF 格式的拼接大图，系统将提示您提供额外的显微镜详细信息，这些信息对于准确推导模板至关重要。如果无法获取如下显微镜配置的信息，您也可以直接使用系统推荐的默认值，但还是建议尽可能跟显微镜工程师沟通获取准确的信息。

图像质控全流程可以分为两大步骤：图像质控评估和图像压缩。如果您选择了上传，会增加图像上传的进度及状态，图像成功上传也是您质控全流程中一个重要的部分。QC 全流程运行完成，界面会展示图像质控指标的状态、分数、耗时、评估结果及进一步分析的建议等信息。

QC 运行完成后，可以直接在界面中查看QC 后的文件路径。您也可以在 StereoMapWorkspace -> QC 保存路径中查看 QC 后的结果文件，保存路径可以在设置中更改。

如果您需要对多个图像同时做 QC，您可以为每张图片添加单独的 tab 页面，填写必要的信息后提交任务，所有的任务将在后台按顺序逐一执行。

如果您的图像数据是 QC 成功的，可以通过--image-tar参数，将 QC 输出的.tar.gz给到SAW count模块将图像数据跟矩阵数据一起分析。相反，如果您的图像数据 QC 未通过，又想做图像跟矩阵的可视化展示，需要将图像文件输入Image Processing 做手动处理后再接回 SAW。

QC 输入文件说明

核染色图像：ssDNA 或者 DAPI

输入文件示例:

文件格式	示例
`.tif` /`.tiff` 拼接大图
QC 的输出文件`.tar.gz`
`.tif`小图	Motic: STOmics Go Optical: Leica:
其它格式

核染色图像的评估主要基于 track 线评估。

通常情况下，一张 S1 的核染色图像（10 倍物镜，8 位深的.tif，约20,000 像素 x 20,000 像素）QC 的时长大约为 1 分钟。

如果图像较大或位深度为 16 位，则 QC 的处理时间会相对更长。

核染色+免疫荧光图像：DAPI+mIF

输入文件示例：

请将您的图像或图像文件夹按照如下规则重新命名，以便软件可以解析染色类型及 IF 的从名称。注意："<>"内是需要替换的信息。

DAPI: <芯片号>
IF: <芯片号>_< IF名称 >_IF

文件格式	示例
`.tif` /`.tiff` 拼接大图
QC 的输出文件`.tar.gz`
`.tif`小图文件	Motic: STOmics Go Optical:
其它格式	Zeiss multi-page `.czi`

核染色+免疫荧光图像的评估主要基于：track线评估、拼接评估和校准评估个指标，该指标都是 QC 是否通过的主要指标。

通常情况下，一张 S1 的核染色图像加二张IF图像（10 倍物镜，8 位深的.tif，约 20,000像素 x 20,000像素）QC 的时长大约为 3 分钟。

如果您输入的是小图文件或者 16 位深的图像，预期的时间将会更长，因为会额外增加解析的时长及拼接评估，每张图像的拼接评估大约为 2 分钟。

H&E图像：H&E

输入文件示例：

文件格式	示例
`.tif` /`.tiff` 拼接大图
QC 的输出文件`.tar.gz`
`.tif`小图文件	Motic: STOmics Go Optical:
其它格式

H&E 图像的评估主要是基于 Track 线评估，确保在显微镜下可以看到清晰的 track 线是至关重要的，对于算法来说，识别 H&E 彩色图像的 track 线比灰度图像具有更大的挑战。

通常情况下，一张 S1 的核染色图像（10 倍物镜，48 位深的.tif，约 20,000 像素 x 20,000像素）QC 的时长大约为 4 分钟。

因 H&E 图像是一种彩色的图像，其大小约为灰度图像的三倍，因此图像解析时间将会更长。此外，如果您输入的数据为小图文件或者 QC 后的.tar.gz由于图像拼接和解析时间较长，预期的时间成本也会更高。

上传设置

主要配置 QC 后图像的上传方式，包括 HPC 或者云上传，如果对于上传方式有任何疑问，请随时与 FAS 沟通。

内置的上传路径

上传类型	描述	区域
ALICLOUD	ALICLOUD 为阿里云上传方式，适合将分析流程部署在阿里云的片区用户。如有其他新增片区，请联系总部 FAS，帮助更新后台配置表。	SINGAPORE, AP
AWS	AWS 为亚马逊云上传方式，适合将分析流程部署在 AWS 云的片区用户。如有其他新增片区，请联系总部 FAS，帮助更新后台配置表。	CALIFORNIA, US RIGA, EU SINGAPORE, AP
HPC	HPC 为实验室内部网络的配置，直接上传到片区的集群，需要联系 FAS 提前做好网络配置，适合华大内网使用。	CHONGQING, CN SHENZHEN, CN
RAYSYNC	RAYSYNC 为镭速上传，连接互联网即可通过镭速上传到深圳集群无需做其他配置。	CHONGQING, CN QINGDAO, CN SHENZHEN, CN