Stereo-CITE T FF

时空试剂盒信息

STOmics Stereo-CITE 蛋白转录组套件旨在同时检测同一组织切片上的全转录组和 100 多重蛋白。SAW 分析来自 Stereo-seq 芯片的新鲜冷冻 (FF) 样本的测序数据。工作流程图如下所示：

--kit-version 是开启分析前需要确认的重要信息，可参考 STOmics 的 Stereo-CITE 蛋白转录组试剂套装使用说明书。

*T 代表 Chip T 芯片

根据上面的关系对应表，确认运行 SAW count 分析所需的 --kit-version 参数信息。

输入文件

SAW count 分析流程需要输入以下文件：

• Stereo-seq Chip T 芯片 mask 文件 (--mask)
• 时空测序基因表达 FASTQ 数据 (--fastqs)
• 时空测序 ADT FASTQ 数据 (--adt-fastqs)

• 显微镜图像支持TIFF或 StereoMap QC模块输出的图像.tar.gz文件
  • --image参数支持直接输入显微镜拼接大图TIFF
  • --image-tar参数支持输入 StereoMap QC模块输出的图像.tar.gz文件
• 参考库 --ref-libraries ，CSV文件格式，其中包含：
  • 蛋白列表，包括抗体信息。此文件可在蛋白列表找到
  • 转录组reference目录， 包含物种的参考基因组 (FASTA) 和注释文件 (GTF/GFF)
    • 参考基因组的索引文件需要预先构建，可使用 SAW makeRef
    • 分析流程会自动对注释文件的格式进行检查，也可以单独调用 SAW checkGTF 进行格式检查

运行 SAW count

根据 SAW 参数命令说明，或直接在命令行中输入 saw count --help，获取可用参数信息。在运行分析流程之前，确认已从 STOmics Cloud 平台下载芯片 mask 文件。

输入数据准备完毕后，根据图像 QC 结果选择合适的操作路径。

标准分析流程

使用 Stereo-CITE FF 样本的测序数据进行比对和注释，输出空间特征表达矩阵，基于显微镜拍照图像，标准流程调用自动配准、组织分割、细胞分割和细胞修正算法对图像进行处理，结合表达矩阵数据和图像结果进行分析，使用下面的代码命令行开启SAW count分析：

cd /saw/runs

saw count \
    --id=<task_id> \
    --sn=<SN> \
    --omics=transcriptomics,proteomics \
    --kit-version="Stereo-CITE T FF V1.0" \
    --sequencing-type="PE100_50+100" \
    --chip-mask=/path/to/chip/mask \
    --organism=<organism> \
    --tissue=<tissue> \
    --fastqs=/saw/datasets/STOmics-RNA-fastqs \
    --adt-fastqs=/saw/datasets/STOmics-ADT-fastqs \
    --ref-libraries=/saw/datasets/reference/ref_libraries.csv \
    --image-tar=/path/to/image/tar

详细教程请参考 Stereo-CITE FF 分析 部分。

手动图像处理

运行一次SAW count 标准分析流程后，可以从结果文件中获取 visualization.tar.gz 文件，下载至本地解压后，可在 StereoMap 中进行可视化查看和手动图像操作。经过一系列手动处理后，新生成的图像 .tar.gz 被传回 SAW realign，重启分析流程。

cd /saw/runs

saw realign \
    --id=<task_id2> \
    --sn=<SN> \
    --count-data=/path/to/previous/SAW/count/task/folder \
    --realigned-image-tar=/path/to/realigned/image/tar

详细教程请参考 手动图像处理 部分。

输出结果

下面列出了SAW count 的输出文件目录结构和内容：

Demo_Mouse_Thymus
├── pipeline-logs
├── STEREO_ANALYSIS_WORKFLOW_PROCESSING
└── outs
    ├── analysis
    ├── bam
    ├── feature_expression
    ├── image
    ├── <SN>.report.html
    └── visualization.tar.gz

进一步探究流程输出结果 ：

• 跳转至HTML报告解读；
• 熟悉 visualization.tar.gz 可视化文件；
• 了解输出结果中的各种文件类型。