手动图像处理

为什么要进行手动处理？

• 在某些情况下，SAW count 的输出结果不够完美，分析人员可能希望手动调整图像（需要结合表达矩阵），或使用第三方工具的算法处理结果，来得到令人满意的分析结果。
• 当数据的图像 QC 结果为不成功时，分析人员必须手动完成显微镜图像与空间特征表达矩阵之间的配准。

通常来说，细致的手动调整会让分析流程生成更准确的表达矩阵数据，用于下游生信分析。

SAW realign 概览

FF 和 FFPE 组织样本经手动处理过后都可以使用 SAW realign 重启分析， 在启动分析任务前，通常需要准备好以下文件：

• 相关联的 SAW count 的输出目录；
• 来自 StereoMap 的经过手动调整的图像.tar.gz 文件（包含手动处理信息）

输出结果主要包括：

• 由关联 SAW count 分析而来的表达矩阵相关数据；
• 处理后的图像文件；
• 不同维度的基因表达矩阵；
• 聚类​​和差异表达分析结果；
• 可视化文件 visualization.tar.gz ， 用于 StereoMap。

当你没有提供显微镜图像数据用于分析时， StereoMap 输出的 lasso GeoJSON 可用作于进行再一次的组织分割，以提取新的 .tissue.gef 矩阵。

第一次运行 SAW count

SAW count 的输入数据大致可分为三类：

• 图像 QC 结果为成功
  • 包括在 StereoMap 图像处理步骤2中完成了打点配准
• 图像 QC 结果为失败
• 没有显微镜图像

以上三种情况，运行 SAW count 后，输出目录中都会包含下列文件：

Demo_Data
├── pipeline-logs
├── STEREO_ANALYSIS_WORKFLOW_PROCESSING
└── outs
    ├── analysis
    ├── bam
    ├── feature_expression
    ├── image
    ├── <SN>.report.tar.gz
    └── visualization.tar.gz

对于 QC 失败图像或无图像的分析任务，组织分割是基于表达矩阵数据进行的，因此这两种情况下的任务不会调用标准分析流程中的自动图像算法。

手动处理

StereoMap 中可以实现手动调整，包括图像-矩阵配准、手动组织分割和手动细胞分割，所有这些操作都可以 StereoMap 的Image Processing模块完成，实时看到修改修过，所见即所得。

配准

形态学配准

图像形态学配准需要同时使用表达矩阵和显微镜图像，根据组织形态，分析人员可以将两个图像层靠拢对齐，直到配准效果达到分析人员的要求，配准操作对于后续步骤非常重要。

打点配准

打点配准操作只需要一张显微镜图像。StereoMap 会根据你给出的芯片左下角第一个特征点，以及预定义规则的芯片 mask 信息，自动计算影像图与矩阵配准参数。需要注意的是：

• 图像 QC 结果为成功，因为要确保 track 线是可见的。
• 有预定义规则的 Stereo-seq 芯片: Stereo-seq N FFPE V1.0, Stereo-seq T FF V1.3, or Stereo-CITE T V1.1 。
• 输入 .tar.gz 或 .stereo 文件中对应的 .tar.gz 是由 StereoMap >= 4.1 生成的

组织分割

组织分割是指通过识别样本的生物学组织形态来探测其组织区域，借助显微镜图像，分析人员可识别组织样本在 Stereo-seq 芯片上的相对位置。

细胞分割

细胞分割是指通过识别细胞的形态来探测单个细胞的区域，根据细轮廓信息，可以进行细胞维度的深入分析和研究。

回到 SAW realign

使用 QC 成功的图像

本教程的第三部分至关重要，因为上一次 SAW count 分析任务的输出结果将帮助 SAW realign 以完成剩余工作，直到生成 HTML 报告。

cd /saw/runs

saw realign \
    --id=Adjusted_Demo_Mouse_Brain \
    --sn=SS200000135TL_D1 \
    --count-data=/path/to/previous/SAW/count/task/folder \
    --realigned-image-tar=/path/to/realigned/image/tar

SAW realign 和 SAW count 一样，会根据细胞分割结果自动对细胞轮廓进行外扩，默认为 10 个像素，可以通过设置 --adjusted-distance 来调整，可根据不同的组织样本和细胞类型来调整细胞轮廓的校正程度。

假如对细胞分割结果（手动处理或第三方工具生成的结果）非常满意，可以设置 --adjusted-distance=0 来关闭细胞修正功能。

如果只想获得手动调整后的压缩图像 .tar.gz 文件中的图像数据或表达矩阵矩阵，可以调用 --no-matrix 或 --no-report 参数。

运行分析，如下所示：

cd /saw/runs

saw realign \
    --id=Demo_Mouse_Brain_Only_Images \
    --sn=SS200000135TL_D1 \
    --count-data=/path/to/previous/SAW/count/task/folder \
    --realigned-image-tar=/path/to/realigned/image/tar \
    --no-matrix

使用 QC 失败的图像

在重启分析之前，必须对图像 QC 失败的数据完成手动配准操作，需要结果显微镜图像与表达矩阵。

cd /saw/runs

saw realign \
    --id=Adjuated_Demo_Mouse_Brain \
    --sn=SS200000135TL_D1 \
    --count-data=/path/to/previous/SAW/count/task/folder \
    --realigned-image-tar=/path/to/realigned/image/tar

无图场景

来自 StereoMap 的lasso GeoJSON 文件可以用于 SAW realign 分析流程，重新分割组织区域。

运行分析，如下所示：

cd /saw/runs

saw realign \
    --id=Lasso_Demo_Mouse_Brain \
    --sn=SS200000135TL_D1 \
    --count-data=/path/to/previous/SAW/count/task/folder \
    --lasso-geojson=/path/to/lasso/GeoJSON

SAW realign 输出结果

分析任务运行结束后，在工作目录下会生成一个名为 Adjusted_Demo_Mouse_Brain 的输出文件夹，它的命名取决于 --id 参数，当--id参数没有启用时取决于 --sn 参数的信息。

SAW count 分析任务通常在工作目录下开启，在该目录下，将找到一个名为 --id 或 --sn（当--id参数没有启用时）的文件夹。输出结果依据数据类型被分类，主要文件被保存在 /outs下。

下面列出了 SAW realign 的输出文件目录结构和内容：

Adjusted_Demo_Mouse_Brain
├── pipeline-logs
├── STEREO_ANALYSIS_WORKFLOW_PROCESSING
└── outs
    ├── analysis
    ├── bam
    ├── feature_expression
    ├── image
    ├── <SN>.report.tar.gz
    └── visualization.tar.gz

进一步探究流程输出结果 ：

• 跳转至HTML报告解读；
• 熟悉 visualization.tar.gz 可视化文件；
• 了解输出结果中的各种文件类型。