比对索引构建

对于参考基因组和注释文件，SAW 软件提供了两个辅助分析流程，SAW makeRef 和 SAW checkGTF， 在运行 SAW count 分析任务之前，需要预先构建一个或多个参考基因组的索引文件。

SAW makeRef

用于构建SAW count需要参考基因组索引文件的辅助分析流程。

转录组比对

STAR 索引文件

需要注释文件 （GTF/GFF） 和参考基因组 （FASTA） 来构建索引文件，用于测序 reads 的比对和注释。

cd /saw/datasets/reference

saw makeRef \
    --mode=STAR \
    --fasta=/path/to/FASTA1 \
    --gtf=/path/to/GTF/or/GFF \
    --genome=./transcriptome

运行命令行后，程序会自动生成 SAW 分析所需的目录结构，在 --genome 目录下生成索引文件和其他相关文件，包括:

• ./transcriptome/fasta- 所有输入 FASTA 文件
• ./transcriptome/genes - 注释文件
• ./transcriptome/STAR 由 STOmics Tech 优化算法后的 STAR 索引文件

/saw/datasets/reference/transcriptome
├── fasta
│     └── genome.fa
├── genes
│     └── genes.gtf
└── STAR
      ├── chrLength.txt
      ├── chrNameLength.txt
      ├── chrName.txt
      ├── chrStart.txt
      ├── exonGeTrInfo.tab
      ├── exonInfo.tab
      ├── FMindex
      ├── geneInfo.tab
      ├── Genome
      ├── genomeParameters.txt
      ├── SA
      ├── SAindex
      ├── SAindexAux
      ├── sjdbInfo.txt
      ├── sjdbList.fromGTF.out.tab
      ├── sjdbList.out.tab
      └── transcriptInfo.tab

添加 rRNA 信息至参考基因组

如果计划在 SAW 分析中去除 rRNA 片段，使用 --rRNA-FASTA 参数来指定 rRNA 信息，将添加其到参考基因组 --fasta 中。

cd /saw/datasets/reference

saw makeRef \
    --mode=STAR \
    --fasta=/path/to/FASTA \
    --gtf=/path/to/GTF/or/GFF \
    --rRNA-fasta=/path/to/rRNA/FASTA \
    --genome=./transcriptome_with_rRNA

输出结果和目录结构不变：

/saw/datasets/reference/transcriptome_with_rRNA         
├── fasta
│     └── genome.fa
├── genes
│     └── genes.gtf
└── STAR
      ├── chrLength.txt
      ├── chrNameLength.txt
      ├── chrName.txt
      ├── chrStart.txt
      ├── exonGeTrInfo.tab
      ├── exonInfo.tab
      ├── FMindex
      ├── geneInfo.tab
      ├── Genome
      ├── genomeParameters.txt
      ├── SA
      ├── SAindex
      ├── SAindexAux
      ├── sjdbInfo.txt
      ├── sjdbList.fromGTF.out.tab
      ├── sjdbList.out.tab
      └── transcriptInfo.tab

快速使用

SAW count 分析对所使用的索引文件目录结构有要求，请按如下方式设置 --reference参数：

...
--reference=/saw/datasets/reference/transcriptome
or 
--reference=/saw/datasets/reference/transcriptome_with_rRNA

微生物分析

SAW count 支持对 Stereo-seq FFPE 的组织样本开展微生物分析，如果你的样本适用微生物比对分析，请在运行 SAW count 时同时设置 --microorganism-detect 和 --ref-libraries

在启动分析之前，应分别构建所需的索引文件，STAR 用于宿主的转录组比对，Bowtie2 用于去除宿主的基因组， Kraken2 用于微生物的探索和分类。

Bowtie2 索引文件

在 SAW count 分析流程中，在进行微生物比对分析前，需要使用 Bowtie2 工具从 unmapped reads 中去除宿主的基因组信息。

#Scenario 1
cd /saw/datasets/reference

saw makeRef \
    --mode=Bowtie2 \
    --fasta=/path/to/host/FASTA1,/path/to/host/FASTA2,... \
    --basename=mouse_genome_rRNA \
    --genome=./Bowtie2

运行命令行后，输出目录包含这些文件：

/saw/dataset/reference/Bowtie2
├── mouse_genome_rRNA.fa  #Host FASTA
├── mouse_genome_rRNA.1.bt2  ##Bowtie2 index files, suffixed with .bt2
├── mouse_genome_rRNA.2.bt2
├── mouse_genome_rRNA.3.bt2
├── mouse_genome_rRNA.4.bt2
├── mouse_genome_rRNA.rev.1.bt2
└── mouse_genome_rRNA.rev.2.bt2

# Senario 2
cd /saw/datasets/reference

saw makeRef \
    --mode=Bowtie2 \
    --params-csv=/path/to/parameter/setting/Bowtie2_build.csv

--params-csv 中的参数设置内容：

Parameter,Value
,/path/to/host/FASTA1,/path/to/host/FASTA2,...
,<basename>

Kraken2 索引文件

Kraken2 是专为基因组的生物分类比对而设计开发的生信工具，在 SAW count 微生物比对分析中，可以快速准确地识别环境样本或复杂微生物群落中存在的微生物，你可以从 Kraken2 数据库网站 下载所需数据库。

#Scenario 1 
cd /saw/datasets/reference

##Step 1 (optional) if needed,add FASTAs needed for a customed database
saw makeRef \
    --mode=Kraken2 \
    --fasta=/path/to/host/FASTA1,/path/to/host/FASTA2,... \
    --database=/path/to/Kraken2/database

##Step 2 build
saw makeRef \
    --mode=Kraken2 \
    --database=/path/to/Kraken2/database

运行命令行后，输出目录包含以下文件：

/saw/datasets/reference/Kraken2_db1
├── hash.k2d  ##Contains the minimizer to taxon mappings
├── opts.k2d  ##Contains information about the options used to build the database
├── taxo.k2d  ##Contains taxonomy information used to build the database
├── inspect.txt
├── seqid2taxid.map
├── database100mers.kmer_distrib
├── database150mers.kmer_distrib
├── database200mers.kmer_distrib
├── database250mers.kmer_distrib
├── database300mers.kmer_distrib
├── database50mers.kmer_distrib
└── database75mers.kmer_distrib

#Scenario 2
cd /saw/datasets/reference

saw makeRef \
    --mode=Kraken2 \
    --params-csv=/path/to/parameter/setting/Kraken2_build.csv

--params-csv 中的参数设置内容：

Parameter,Value
--add-to-library,/path/to/fasta
--db,/path/to/db

Reference libraries

在为 STAR、Bowtie2 和 Kraken2 构建索引文件后，需要构建一个 --ref-libraries 参数所需的配置 CSV，将微生物比对分析需要用到的数据文件进行整合。

Reference,Type
/saw/datasets/reference/transcriptome,STAR
/saw/datasets/reference/Bowtie2,Bowtie2
/saw/datasets/reference/Kraken2_db1,Kraken2

SAW checkGTF

SAW count 的分析任务只能接受标准格式的注释文件，所以在 SAW count 进行 reads 注释之前会自动校验文件。除了之外，还能够通过它实现特定注释信息内容的提取。

如果注释文件存在以下格式问题（常见的错误），SAW checkGTF 将进行简单地更正，以确保文件能够被正常使用。

运行命令进行注释文件的格式检查：

saw checkGTF \
    --input-gtf=/path/to/input/GTF/or/GFF \
    --output-gtf=/path/to/output/GTF/or/GFF

如果想要提取特定的注释信息，例如： gene_biotype:protein_coding 或 gene_biotype:lincRNA，可以这样运行程序：

saw checkGTF \
    --input-gtf=/path/to/input/GTF/or/GFF \
    --attribute=key:value \
    --output-gtf=/path/to/output/GTF/or/GFF

蛋白列表

根据生物体选择一个合适的蛋白列表，这个文件是 PID 比对需要的。

*蛋白列表 Protein Panel 也可于 SAW demo 数据集 /SAW_Demo_Data/reference/ProteinPanel 中获取。

*查询 Cocktail了解更多细节。

列表指定了时空蛋白转录组Stereo-CITE 实验中使用的抗体。每列由 Tab 分隔，且定义如下：

Reference libraries

用于构建 --ref-libraries 的 CSV文件，整合蛋白列表和转录组 STAR 参考索引。

Reference,Type
/saw/datasets/reference/transcriptome,STAR
/saw/datasets/reference/ProteinPanel.list,ProteinMap