数据再分析

本教程将将展示如何运行辅助分析流程 SAW reanalyze，进行

• cluster 聚类分析
• lasso 区域的表达矩阵提取
• diffExp 差异表达分析
• multiomics 蛋白组&转录组联合分析
• midFilter 基于自定义MID范围过滤矩阵
• removeBackground 自动去除蛋白背景信号

聚类分析

在生信下游分析中，聚类是一种关键且基本的算法处理，可将具有相似特征的空间表达点归为同组，该过程有助于揭示表达数据中的底层结构和模式。

在进行分析前，需要根据数据的物种和组织类型来选择合适的 bin size 例如，哺乳动物细胞的直径约为 10 µm，DNB 的物理间距为 500 nm，因此 bin20 会是一个合适的选择。

调用 Leiden 算法 进行聚类时，--Leiden-resolution 参数的默认值为 1.0，它可以调控 Leiden 聚类时的分群颗粒度，值越大，分群簇越多。并且，可以开启 --marker 参数，基于 Leiden 算法的分群结果进行差异表达分析。

如果使用 bin GEF 进行聚类，运行命令如下：

saw reanalyze cluster \
    --gef=/path/to/input/GEF \
    --bin-size=20 \
    --Leiden-resolution=1.0 \
    --marker \
    --output=/path/to/output/clustering

基于 bin GEF 的聚类输出如下：

clustering
├── <SN>.bin20_1.0.h5ad  ##<SN>.<bin_size>_<resolution>.h5ad, containing analysis results
├── find_marker_genes.csv  ##original output CSV
└── bin20_marker_features.csv  ##formatted CSV for visualization in StereoMap

如果使用 cellbin GEF 进行聚类，运行命令如下：

saw reanalyze cluster \
    --cellbin-gef=/path/to/input/cellbin/GEF \
    --Leiden-resolution=1.0 \
    --marker \
    --output=/path/to/output/clustering

基于 cellbin GEF 的聚类输出如下：

clustering
├── <SN>.cellbin.gef  ##a copy of input cellbin GEF but with new clustering information
├── <SN>.cellbin_1.0.h5ad  ##<SN>.cellbin_<resolution>.h5ad, containing analysis results
├── find_marker_genes.csv  ##original output CSV
└── cellbin_marker_features.csv  ##formatted CSV for visualization in StereoMap

矩阵套索

StereoMap 中的交互式工具可以 lasso （手动圈选）感兴趣区域，它需要 SAW reanalyze 分析流程来协助将 lasso GeoJSON 中区域信息转化为特征表达矩阵。

如果使用 bin GEF 进行 lasso，运行分析如下：

saw reanalyze lasso \
    --gef=/path/to/input/GEF \
    --lasso-geojson=/path/to/lasso/GeoJSON \
    --bin-size=1,20,50 \
    --output=/path/to/output/lasso

基于 bin GEF 的 lasso 输出如下：

lasso
├── <label1>
│       ├── SN.<label1>.label.gef  ##lasso GEF of bin1
│       └── segmentation
│              ├── SN.lasso.<bin_size_list[0]>.<label1>.gem.gz  ##GEM of lasso area of different bin sizes
│              ...
│              ├── SN.lasso.<bin_size_list[n]>.<label1>.gem.gz
│              └── SN.lasso.<label1>.mask.tif  ##mask image of lasso area
└── <label2>
       ├── ...
       └── ...

如果使用 cellbin GEF 进行 lasso，运行分析如下：

saw reanalyze lasso \
    --cellbin-gef=/path/to/input/cellbin/GEF \
    --lasso-geojson=/path/to/lasso/GeoJSON \
    --output=/path/to/output/lasso

基于 cellbin GEF 的 lasso 输出如下：

lasso
├── <label1>
│       └── SN.<label1>.label.cellbin.gef  ##cellbin GEF of lasso area
└── <label2>
        └── ...

差异表达分析

SAW reanalyze 可以使用来自 StereoMap 的 diffexp GeoJSON 文件，基于聚类类群选择和套索区域进行差异表达分析。

运行分析如下：

saw reanalyze diffExp \
    --count-data=/path/to/previous/SAW/count/result/folder/id \
    --diffexp-geojson=/path/to/StereoMap/diffexp/GeoJSON \
    --output=/path/to/output/differential_expression

差异表达分析输出如下：

differential_expression
├── <SN>.<bin_size>_1.0.h5ad  ##H5ad containing analysis results
├── find_marker_genes.csv  ##original output CSV
└── <bin_size>_marker_features.csv  ##formatted CSV for visualization in StereoMap

或：

differential_expression
├── <SN>.cellbin_1.0.h5ad  ##H5ad for cellbin containing analysis results
├── find_marker_genes.csv  ##original output CSV
└── cellbin_marker_features.csv  ##formatted CSV for visualization in StereoMap

蛋白组&转录组联合分析

SAW multiomics 可以整合RNA和蛋白质数据，并通过 TotalVI 变分推断计算潜在空间。对潜在空间进行聚类分析，并进行 one-vs-all 差异表达分析，以找到标记基因和蛋白质。

您可以使用基因和蛋白 bin GEF进行联合分析，运行分析如下：

saw reanalyze multiomics \
    --gef=/path/to/input/gene/GEF,/path/to/input/protein/GEF \
    --protein-panel=/path/to/ProteinPanel.list \
    --bin-size=50 \
    --output=/path/to/output/joint_analysis

或使用基因和蛋白 cellbin GEF进行联合分析：

saw reanalyze multiomics \
    --cellbin-gef=/path/to/input/gene/cellbin/GEF,/path/to/input/protein/cellbin/GEF \
    --protein-panel=/path/to/ProteinPanel.list \
    --output=/path/to/output/joint_analysis

联合分析输出如下：

joint_analysis
├── <SN>.<bin_size>.differential_expression.csv ##original outoput CSV containing differential expression results
└── <SN>.<bin_size>.h5mu ##mutimodal data containing clustering results

或:

joint_analysis
├── <SN>.cellbin.differential_expression.csv ##original outoput CSV containing differential expression results
└── <SN>.cellbin.h5mu ##mutimodal data containing clustering results

基于自定义MID范围过滤矩阵

StereoMap 中的交互式工具可以手动设置 feature 的 MID 范围。

saw reanalyze midFilter \
    --gef=/path/to/input/GEF \
    --mid-json=/path/to/FilterMID.json \
    --output=/path/to/output/mid_filtering

输出如下：

mid_filtering
└── <SN>.filter.gef ##common GEF filtered by MID range

或：

mid_filtering
└── <SN>.protein.filter.gef ##protein GEF filtered by MID range

自动去除蛋白背景信号

一种自动去除非特异性结合蛋白信号的方法。算法细节请查阅 Proteome background removal 。

saw reanalyze removeBackground \
    --gef=/path/to/output/input/protein/GEF \
    --bin-size=50 \
    --protein-panel=/path/to/ProteinPanel.list \
    --output=/path/to/output/removeBackground

基于蛋白 bin GEF 的输出如下：

removeBackground
└── A03684D4.protein.tissue.rmbg.gem.gz ##protein expression matrix after backgrou